1、金黃色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal Protein A，SPA）是金黃色葡萄球菌的細胞壁蛋白，具有與免疫球蛋白特異性結合的能力。SPA被廣泛的應用于抗體分離純化、免疫檢測和診斷等方面，市場需求量巨大。目前所應用的SPA多是以大腸桿菌為表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組蛋白A(rSPA)。此種生產(chǎn)技術中rSPA為大腸桿菌的胞內(nèi)蛋白，發(fā)酵密度不高，后續(xù)純化分離工藝步驟繁瑣復雜，產(chǎn)品得率低，生產(chǎn)成本高。為此，本論文嘗試以含SPA基因的重組畢赤

2、酵母rGS115-spa為表達系統(tǒng)，對其分泌表達的高密度發(fā)酵和后續(xù)純化工藝進行深入研究，嘗試建立了一套新的rSPA大規(guī)模生產(chǎn)工藝。
　　首先，本論文通過搖瓶實驗探索rGS115-spa在搖瓶中的蛋白表達情況，通過對誘導溫度、pH、誘導劑濃度、誘導時間等條件的優(yōu)化，確定相對較優(yōu)的表達條件，為后續(xù)高密度發(fā)酵實驗奠定基礎。
　　其次，在前期搖瓶實驗基礎上，對5L發(fā)酵罐中rSPA的表達條件進行優(yōu)化，包括誘導起始時菌體密度、誘導溫度、

3、pH和誘導時間等，最終確定在菌體密度達到OD600為300-350時開始誘導，溫度22℃，誘導pH為3.0，經(jīng)68 h的誘導后，rSPA產(chǎn)量可達8.8g/L，占發(fā)酵液中總蛋白的80％以上，較大腸桿菌表達系統(tǒng)有明顯提高。
　　然后，利用發(fā)酵所得含rSPA發(fā)酵上清液，進行其分離純化工藝的研究。利用畢赤酵母生產(chǎn)的rSPA是分泌型蛋白，可以省去細胞破碎、DNA沉淀等前處理步驟，但發(fā)酵液中色素及降解片段的去除是rSPA分離純化工藝的難點。由

4、于色素類物質可吸附到大部分層析介質上，影響層析柱使用效果，本論文嘗試利用硫酸銨沉淀或乙醇沉淀偶聯(lián)活性炭吸附和除鹽柱過濾等手段去除色素。綜合色素去除效果、蛋白回收率以及操作簡便性等因素考慮，最終選用除鹽柱進行色素去除。去除大部分色素后的rSPA溶液被置換為25 mM，pH8.0的Tis-HCl緩沖液，經(jīng)過DEAE離子交換層析純化后去除了原發(fā)酵液中降解產(chǎn)物，洗脫液rSPA純度可達色譜純標準，回收率高達79.4％。
　　最后，本論文利用