1、早在上世紀六十年代,美國學者Leonard Hayflick發(fā)現(xiàn)哺乳動物來源的細胞在體外培養(yǎng)的過程中其分裂的次數(shù)是有限的,并且細胞在體外可傳代的次數(shù)與其壽命有關,并由此提出“Hayflick界限”理論。對多細胞有機體來說,衰老是組織內的穩(wěn)態(tài)以及器官功能逐步喪失的過程,成體干細胞廣泛的分布在身體各處,為機體的自我更新和組織修復提供細胞來源,因此人體內自我更新的干細胞有限的分裂能力可能是引發(fā)整個機體衰老的重要原因。近些年,間充質干細胞(Me

2、senchymal stem cells,MSCs)作為一種重要的成體干細胞受到了越來越多的關注。由于其取材方便、易于分離培養(yǎng),低免疫原性,具有多向分化潛能等諸多的優(yōu)點,已經成為了在細胞治療和基因治療等領域較為理想的種子細胞。然而,由于MSCs在體內所占比例較低,在臨床應用之前需要進行大規(guī)模的擴增培養(yǎng)以此來獲得足夠數(shù)量的細胞。但是,MSCs在體外經過長期培養(yǎng)容易衰老,其形態(tài)和生理機能會發(fā)生較大改變。例如:增殖減慢,生長停滯;干性減退,喪

3、失分化能力;甚至具有致瘤性,這些經過長時間培養(yǎng)的MSCs已經不再適用于臨床應用。因此研究MSCs的衰老不僅僅可以使我們多角度的來認識機體發(fā)生衰老的機制,同時還可以為以后的臨床治療提供更優(yōu)質的細胞來源。
　　基于這種目的,我們設計了這個課題,希望在探索MSCs衰老分子機制的同時能夠找出一種可以延長MSCs壽命的新方法。近些年來,很多研究團隊都關注到了沉默信息調節(jié)蛋白2(silent information regulator 2,S

4、IR2)在調節(jié)低等生物抵抗不良環(huán)境以及延長其生存周期等過程中所發(fā)揮的重要作用。同樣,在哺乳動物體內存在的蛋白去乙?；窼IRT1與SIR2高度同源,越來越多的研究也表明SIRT1可以通過調控P53,Ku70,FOXO,E2F1,NF-κB,和PGC-1α等關鍵分子的表達,進而參與調控細胞的衰老、凋亡、代謝等生理活動。為了研究SIRT1在MSCs衰老中的作用,我們通過慢病毒穩(wěn)定轉染體系將SIRT1的干涉表達和過表達載體分別導入到MSCs中

5、,同時結合細胞增殖和衰老等相關指標的檢測,來研究SIRT1對MSCs增殖和衰老的影響。
　　首先在研究當中,我們觀察到骨髓和脂肪來源的MSCs在體外經過長時間培養(yǎng)之后,出現(xiàn)生長停滯、細胞形態(tài)變大扁平等衰老特征,衰老相關半乳糖苷酶染色(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)表明隨著細胞不斷的傳代,衰老細胞的比例逐漸增多,SIRT1蛋白水平的表達會隨著細胞不斷的傳代而顯著的下降。

6、雖然不同組織來源、不同個體來源的SIRT1的下調水平略有不同,但是整體趨勢是一致的。這就提示我們,SIRT1在MSCs衰老的進程當中可能會發(fā)揮著重要的作用。
　　因此,我們先通過抑制SIRT1的表達來研究SIRT1與衰老發(fā)生之間的關系。在研究當中,我們利用慢病毒轉染體系結合RNA干涉技術,在早期骨髓和脂肪來源的MSCs中成功地下調SIRT1的表達(干涉效率﹥90％)。為排除ShRNA潛在的脫靶效應,我們選擇了兩套針對SIRT1序列

7、不同位點的ShRNA。通過BrdU摻入實驗和PI染色實驗可以發(fā)現(xiàn),在下調表達SIRT1的骨髓和脂肪來源的MSCs中,處于增殖期的細胞數(shù)目分別為對照組的32%和45%,生長曲線也表明細胞增殖顯著減慢。通過SA-β-gal衰老特異染色我們發(fā)現(xiàn),在長時間的培養(yǎng)過程中,SIRT1的下調表達會明顯的促進細胞的衰老,衰老細胞的數(shù)目在兩種不同類型的MSCs中分別增加5.5倍和4.7倍。上述結果表明抑制SIRT1的表達會降低MSCs的增殖,加速細胞的衰

8、老,SIRT1在維持MSCs未衰老狀態(tài)中發(fā)揮著不可或缺的作用。
　　接下來我們從反面驗證,SIRT1的過表達是不是可以促進MSCs的增殖或者延緩MSCs的衰老甚至是逆轉衰老的細胞。同樣,我們利用慢病毒轉染體系,在骨髓來源的MSCs當中成功過表達SIRT1以及無酶活性的負顯性突變體SIRT1-H363Y,我們發(fā)現(xiàn)突變載體H363Y的作用與下調SIRT1表達的效果類似。在轉染早期,細胞增殖減慢,處于增殖期細胞數(shù)目減少5.9倍,衰老細胞

9、數(shù)目增加4.9倍。而在此時,是否過表達SIRT1對細胞的增殖與衰老影響不大,然而隨著轉染細胞不斷的傳代,過表達SIRT1的MSCs與對照組相比,處于增殖期的細胞數(shù)目是對照組的2.7倍,衰老的細胞數(shù)目卻只有對照組的56%,細胞增殖期延長30天左右才會進入到平臺期。但是,SIRT1過表達的MSCs最終還是會出現(xiàn)生長停滯的現(xiàn)象,進入衰老期。因此,我們可以得出結論,通過體外過表達SIRT1可以延緩細胞的衰老,但是不能終止衰老的進程。
　　

10、雖然,在MSCs中過表達SIRT1可以延緩細胞衰老,但是對于以后可能的臨床應用,我們還要保證SIRT1過表達修飾過的MSCs仍然具有干細胞的分化潛能。我們通過流式檢測了MSCs相關的表面標志如CD31、CD34、CD90和CD105的表達,以及其成脂與成骨的分化潛能。結果表明:SIRT1過表達不會導致MSCs的分化,基因修飾之后的MSCs仍然具有分化潛能,這也從另外一個角度說明了SIRT1對MSCs增殖的影響與其分化能力的改變無關。

11、r>　　為了進一步探索SIRT1調控MSCs衰老的機制,我們著重檢測了衰老相關信號通路當中的兩個關鍵分子P21Cip1與P16INK4a的表達變化情況。我們發(fā)現(xiàn):SIRT1下調之后引起骨髓來源MSCs的衰老,P16INK4a的表達明顯升高,P21Cip1的變化并不顯著;對于脂肪來源的MSCs來說,P21Cip1與P16INK4a的表達卻均有升高。在長時間培養(yǎng)的過程中,SIRT1的過表達可以減緩P16INK4a的積累,但對P21Cip1表

12、達的影響不大。這些結果表明,SIRT1影響骨髓來源的MSCs的衰老主要是通過P16INK4a信號通路并不是P21Cip1通路,同時可以看出衰老發(fā)生的機制在不同組織來源的MSCs當中略有不同。
　　上述結果可以明確證實SIRT1可以通過調控P16INK4a的表達來影響MSCs的增殖與衰老。為了更好的應用于臨床,我們考慮是否能夠將以激活SIRT1為靶點的小分子作為激動劑加入到MSCs的培養(yǎng)體系當中。從葡萄皮當中提取的天然化合物白藜蘆醇

13、,被很多人當作SIRT1的天然激活劑,但是它的作用卻很有爭議。因此,我們在課題當中檢測不同濃度的白藜蘆醇以及不同的作用時間能否促進MSCs增殖和延緩細胞衰老。我們發(fā)現(xiàn)5μM和20μM的白藜蘆醇作用兩天,可以促進MSCs增殖,但是上述濃度的白藜蘆醇持續(xù)長時間作用反而加速了MSCs的死亡,這表明高濃度的白藜蘆醇具有毒性。由此可見,白藜蘆醇只能瞬時的促進MSCs的增殖。
　　綜上所述,我們的課題研究不僅可以使我們很好地理解SIRT1在M

14、SCs衰老過程中的作用,還有利于進一步分析SIRT1在MSCs衰老過程中的機制,同時還提供了一個可以延緩間充質干細胞衰老的新策略。
　　藥物、酒精等因素引起的終末期肝病是困擾人類健康的一類頑疾。目前,肝細胞移植、生物人工肝以及組織工程化肝臟等治療方法的研究為終末期肝病的治療帶來新的希望。但令人遺憾的是,肝細胞來源受限、數(shù)量不足以及功能欠缺等因素制約了其進一步應用。胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESCs)具有

15、分化的全能性以及高度自我更新能力,成為較為理想的種子細胞。各國科研人員通過模擬肝臟在體內的發(fā)育環(huán)境采用分步誘導的方式,使ESCs依次經定型內胚層階段、肝干細胞階段、肝祖細胞階段、最終分化為肝細胞。通過近幾年不斷的優(yōu)化誘導條件,人們可以將胚胎干細胞向定型內胚層(流式檢測CXCR4+和SOX17+雙陽性)的效率提高到90%以上,進一步誘導為肝干/祖細胞階段,其標志性蛋白AFP的陽性率也在93%,即使最終肝細胞特異標志蛋白ALB和α1-AT的

16、陽性率也在90%以上,但是成熟肝細胞的標志ASGPR最高也只在60%左右,同時所獲得肝細胞在生物功能上與正常肝細胞仍有很大的差別。而獲得成熟有功能的肝細胞無論對終末期肝病的治療還是對藥物篩選平臺的建立都有重要意義。因此,我們將重點關注胚胎干細胞向肝細胞分化過程中肝干/祖細胞向肝細胞的分化這一階段,此階段是得到有功能的成熟肝細胞的關鍵。
　　肝臟是一個復雜的異質性器官,其中肝實質細胞和非實質細胞有序穩(wěn)定的排列,保證了細胞與細胞之間相

17、互通訊,繼而保障肝臟發(fā)揮正常的功能。不同類型的細胞連接決定了細胞與細胞之間有序的排列。因此我們考慮是否能夠通過增強細胞之間的連接來促進細胞之間的有序排列從而促進肝前體細胞進一步發(fā)育,最終得到功能穩(wěn)定的成熟的肝細胞。肝組織內各細胞之間存在大量的緊密連接、縫隙連接、橋粒及半橋粒等不同類型的連接。其中縫隙連接不僅是細胞與細胞之間物質運輸?shù)耐ǖ?還可以和很多蛋白偶聯(lián),受它們的調控或借助它們調控下游的分子從而發(fā)揮更大的功能。縫隙連接蛋白Conne

18、xin32和Connexin43(CX32/CX43)是肝臟中最重要的兩類縫隙連接蛋白。我們發(fā)現(xiàn)二者的表達在肝干細胞向肝細胞轉變過程中出現(xiàn)同步 相反的變化,即在肝祖細胞階段CX32低表達而CX43高表達,隨著向肝細胞的分化CX43表達降低CX32表達則會升高。這一現(xiàn)象提示二者表達變化可能在肝干細胞向肝細胞分化及成熟過程中發(fā)揮重要作用,同時CX32/CX43的這種同步上調與下調表達又有可能受到什么關鍵分子的調控?在本部分實驗中,我們開展了

19、縫隙連結蛋白CX32/CX43在肝干/祖細胞向肝細胞分化中的作用及其機制研究。希望從細胞與細胞之間相互作用的角度來尋找肝細胞分化成熟的新機制,同時探索其中可能的分子機制,最終目的在于引入新策略進一步優(yōu)化胚胎干細胞向肝細胞的誘導分化體系。
　　我們使用目前較為公認的肝干/祖細胞系(WB-F344)作為研究對象,該細胞系易于在體外培養(yǎng)和進行基因操作,且具備向膽管上皮細胞以及肝細胞的雙向分化潛能,其所處的發(fā)育階段與我們要重點關注的胚胎干

20、細胞向肝細胞分化的過程中的肝祖細胞階段類似。我們對 WB-F344 進行雙向的誘導分化,通過 Realtime PCR 和Western blot、免疫熒光檢測相關基因和蛋白的表達,我們發(fā)現(xiàn)WB-F344向肝細胞分化中存在CX43表達下調、CX32上調的規(guī)律,而向膽管分化過程中則呈現(xiàn)出相反的變化,這與CX43和CX32在體內的分布具有一致性,即CX32僅高表達在肝細胞膜表面,CX43在膽管附近有干性的細胞中高表達。
　　為了能夠更

21、好的研究CX43和CX32表達變化與肝向分化之間的關系,我們構建了CX32和CX43慢病毒表達載體和CX43干涉表達載體,并分別建立起穩(wěn)定轉染上述載體的WB細胞系。將其放在向肝細胞分化的條件下誘導,結果表明:CX32過表達以及CX43下調表達對于肝干/祖細胞向肝細胞的分化都有很好的促進作用。接下來,我們考慮既然CX32/CX43在肝干/祖細胞向肝細胞分化成熟的過程中所表現(xiàn)出來這種同步逆向的表達變化會顯著促進肝細胞的分化，那么有沒有可能C

22、X32/CX43共同接受同一關鍵分子的調控，才使得它們上調與下調表達同步進行？我們發(fā)現(xiàn)p38MAPK在肝干/祖細胞向肝細胞分化成熟的過程中是一個去磷酸化的過程，同時在大鼠的肝臟當中，我們發(fā)現(xiàn)磷酸化的p38MAPK更多的表達在匯管區(qū)，也就是肝前體細胞富集的區(qū)域，提示抑制p38MAPK磷酸化水平有利于肝干/祖細胞向肝細胞分化。我們通過體內試驗證實，p38MAPK的小分子抑制劑可以調控CX43和CX32的表達。我們將p38MAPK的小分子抑制

23、劑加入到肝干/祖細胞向肝細胞誘導分化體系當中，p38MAPK的小分子抑制劑可以明顯的抑制CX43的表達，促進CX32的表達，從而促進肝干細胞向肝細胞的分化。然而CX43的過表達會減弱p38MAPK的小分子抑制劑的作用。除此之外，我們還利用體外分離純化的原代大鼠的肝干細胞，進一步驗證了p38MAPK的小分子抑制劑對CX32/CX43的表達調控作用，也得到了較一致的結論。
　　在前面的工作當中，我們的實驗結果可以很好的證實無論是在WB

24、-F344細胞系還是在體外分離的大鼠原代肝干細胞向肝細胞分化過程中，p38MAPK均可以通過調控細胞連接蛋白的表達來促進肝干/祖細胞向肝細胞的分化。因此，我們將p38MAPK的抑制劑用于人胚胎干細胞向肝細胞的誘導分化過程中肝干/祖細胞階段向成熟肝細胞的階段。實驗結果初步表明p38MAPK的抑制劑對CX43的抑制作用更為明顯，也能夠更好的促進CYP1B1的表達。
　　綜上所述：p38MAPK的小分子抑制劑可以抑制p38MAPK的磷酸