1、重組人生長激素(rhGH)在臨床有著十分廣闊的應(yīng)用前景,在肯定rhGH療效的同時,出現(xiàn)的抗體形成、胰島素耐受、甲狀腺機能減退、價格昂貴、長期注射不便等問題也引起了人們的關(guān)注[1]。因此,研究人員積極尋找更簡便、更有效的能夠促進垂體生長激素分泌的藥物。1982年,研究人員在腦啡肽類似物結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上合成了第一個對生長激素分泌有刺激效應(yīng)的非天然生物活性肽,此肽由6個氨基酸組成,其中包含兩種D型氨基酸,稱為生長激素釋放肽-6(Growth ho

2、rmone releasing peptide-6, GHRP-6)[2]。隨后幾年,研究組又在 GHRP-6的基礎(chǔ)上合成了七肽的GHRP-1和六肽的GHRP-2,這兩種活性肽刺激生長激素分泌的作用較GHRP-6更強[3-4]。這幾種 GHRP除了有較強的促進生長激素釋放的作用外,GHRP對心血管功能、攝食、脂肪細胞分化、胃酸分泌和胃腸運動的調(diào)節(jié)等作用也引起了人們注意,尤其是 GHRP對心臟功能多方面的調(diào)節(jié)和改善作用成為近年來研究的熱點

3、[5]。GHRP沒有物種專一性,在動物體內(nèi)具有促進生長激素釋放、刺激動物食欲、促進動物生長、影響動物生產(chǎn)性能和提高動物免疫水平等多方面的功能,GHRP的研究發(fā)展對畜牧業(yè)生產(chǎn)也具有十分重要的意義[6]。
　　目前,國內(nèi)外對 GHRP的作用機制、生理作用等進行了大量的理論和實踐研究,國內(nèi)在上世紀90年代已有Boc固相合成策略合成GHRP-6的報道[7]。近來研究多集中在GHRP藥理研究上,在此基礎(chǔ)上,探索GHRP的合成方法,優(yōu)化合成工

4、藝,降低合成成本,成為越來越重要的課題。GHRP通過大量的結(jié)構(gòu)改造而來,含有多種芳香族氨基酸,其序列中的D型氨基酸能夠有效地抑制蛋白酶的識別和水解,使其各種給藥途徑的利用率比其他肽類藥物都高,對維持多肽的生物活性起著重要作用[8]。本課題采用Fmoc固相合成策略,以Rink Amide-AM樹脂為載體,選擇碳二亞胺型縮合試劑DIC,在活化中添加HOBt試劑減少消旋副反應(yīng),逐步縮合完成接肽反應(yīng),通過幾種不同的切割試劑將粗肽從樹脂上切割下來

5、,比較其切割效果。粗肽經(jīng)半制備高效液相色譜儀分離純化,再冷凍干燥得到最終產(chǎn)物。得到的純肽用 RP-HPLC進行純度分析,ESI-MS進行結(jié)構(gòu)分析鑒定。
　　目的:
　　采用Fmoc固相多肽合成方法合成GHRP-6、GHRP-1和GHRP-2三條短肽,探索影響產(chǎn)物結(jié)果的合成條件、切割條件和純化方法;確立產(chǎn)物的檢測方法;降低合成成本,得到純度較高的目標產(chǎn)物。
　　方法:
　　1 GHRP的固相合成
　　以Fmo

6、c固相合成方法分別合成GHRP-6、GHRP-1與GHRP-2。以合適的樹脂為載體,選擇能夠產(chǎn)生較低消旋率的縮合試劑,控制投料摩爾比和反應(yīng)時間,規(guī)范操作,減少接肽反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物;通過茚三酮檢測反應(yīng)的顏色變化判斷接肽過程中氨基酸的連接程度;探索樹脂替代度對合成反應(yīng)的影響。
　　2 GHRP的切割、純化
　　根據(jù)氨基酸不同的保護集團,選擇不同的切割試劑配方,進行平行實驗;優(yōu)化切割條件,選擇簡便、副反應(yīng)較少的切割方法;切割

7、下來多肽經(jīng)過冰乙醚沉淀,離心收集產(chǎn)物得到粗肽;采用半制備型RP-HPLC分離純化;簡單處理純化后產(chǎn)物后經(jīng)冷凍干燥得到最終產(chǎn)品。
　　3 GHRP的結(jié)構(gòu)分析鑒定
　　通過RP-HPLC對合成的GHRP-6、GHRP-1和GHRP-2的保留時間進行定位、純度分析,對不同切割試劑的切割效果的HPLC圖譜進行比較,對純化前和純化后的多肽HPLC圖譜進行比較;用ESI-MS分析確證分子量。
　　結(jié)果:
　　1 GHRP為肽

8、酰胺的結(jié)構(gòu),選擇Rink Amide-AM樹脂為載體;縮合體系選擇DIC/HOBt,價格低廉,且兩者配合使用能有效的降低消旋率,可以將副反應(yīng)控制在很低的范圍內(nèi);反應(yīng)投料摩爾比在1:4時能夠反應(yīng)充分;反應(yīng)時間一般150min,在連接Phe,His等這些易發(fā)生消旋副反應(yīng)的氨基酸時,避免高溫反應(yīng)環(huán)境,縮短反應(yīng)時間在120min左右;替代度在0.45mmol/g時合成效果較好。
　　2 GHRP-6的3種切割試劑脫除保護基效果相似,所得產(chǎn)

9、物純度也較相近,其中切割溶液TFA:間甲酚(V/V99:1)的配比是最簡便的,成本也最小。GHRP-1、GHRP-2所用兩種切割試劑也能起到很好的效果。切割實驗進行時,反應(yīng)液先在冰浴中反應(yīng)0.5h,再30℃反應(yīng)1h的裂解條件得到的產(chǎn)物副產(chǎn)物少,得率較高。
　　3合成的六肽的GHRP-6、GHRP-2和七肽的GHRP-1經(jīng) RP-HPLC檢測、ESI-MS確定分子量,合成正確;GHRP-6和 GHRP-2經(jīng)半制備RP-HPLC分離純

10、化后純度大于95％,GHRP-1的純度大于85%。
　　結(jié)論:
　　本課題采用 Fmoc固相多肽合成方法合成了六個氨基酸組成的短肽GHRP-6、GHRP-2和七個氨基酸組成的短肽GHRP-1,三條肽中均含有D型非天然氨基酸;在合成中通過選擇消旋率小的縮合試劑,控制反應(yīng)時間來減少副反應(yīng);比較了幾種不同的切割試劑對肽樹脂的切割效果,優(yōu)化了切割條件;半制備RP-HPLC分離、純化得到目標產(chǎn)品純度能夠達到95%以上;所得產(chǎn)物經(jīng)RP-