1、本論文采用PCR擴(kuò)增基因技術(shù),將工程菌株E. coli BL21 (DE3)/ pET28b(+)-panD的panD基因克隆后連接至pET28c(+)載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28c(+)-panD,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E. coli BL21(DE3),經(jīng)卡納霉素抗性篩選獲得了高效表達(dá)L-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pET28c(+)-panD,酶活力為92.52 U/L。將新構(gòu)建的菌株與原菌株E.

2、coli BL21 (DE3)/ pET28b(+)-panD進(jìn)行SDS-PAGE分析比較,發(fā)現(xiàn)新構(gòu)建的菌株能正確表達(dá)PanD,但同樣PanD酶自剪切率低,大部分是未剪切的π’-亞基。以乳糖為誘導(dǎo)劑,對(duì)新構(gòu)建的工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pET28c(+)-panD進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化,得到最適培養(yǎng)條件:乳糖誘導(dǎo)時(shí)間20 h,乳糖濃度12 g/L,誘導(dǎo)溫度為35℃,誘導(dǎo)菌齡為3.5 h,誘導(dǎo)培養(yǎng)基初始pH 5.5。優(yōu)化后

3、酶活力為186 U/L,與未優(yōu)化前相比,酶活力提高101％。對(duì)新構(gòu)建的工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pET28c(+)-panD超聲波破壁后的粗酶液經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)鹽析和Ni-親和層析兩步純化,PanD酶純度在95％以上,比活力達(dá)到了20.15 U/mg,純化倍數(shù)為6.58,回收率為68.34％。通過(guò)對(duì)純酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究,得到最適反應(yīng)溫度為45℃,最適pH為8.0,金屬離子對(duì)酶活力其幾乎無(wú)影響。PanD較穩(wěn)定,高溫可提