1、研究背景和目的： 骨修復是長期以來臨床骨科普遍存在、并急需解決的問題。盡管包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bonemorphogeneticproteins，BMPs)等在內的諸多生長因子已經被研究證明具備明顯的骨誘導性能，但是在實際臨床應用中均存在諸多缺點及不足。正是基于以上研究成果，本研究通過自主創(chuàng)新、篩選并合成了一種胺素類小分子化合物，命名為OIC-A006(Osteogenicinduciblecompound-active006)

2、。本研究詳細探討了該化合物的誘導成骨作用、初步闡明了其產生誘導成骨的作用機制以及綜合評價了其骨修復性能。通過此項工作研究者希望該化合物能夠克服以往骨誘導因子在臨床應用中的不足，并為該化合物的研發(fā)應用和更廣范圍的篩選骨誘導化合物提供理論指導依據。 方法： 取1.5月齡的雄性C57BL/6小鼠，原代培養(yǎng)骨髓間充質干細胞(Bonemarrowstemcells，BMSCs)，在細胞貼壁后第1、3、5、7、9、11、13d應用M

3、TT法檢測BMSCs的增殖活性；當細胞融合至80％，分別以含0、3.1、6.25、12.5和25μM的該化合物條件培養(yǎng)液干預，在干預后第5、10、15、20、25d時，分別應用RT-PCR、Realtime-PCR、組織化學及放免法等技術檢測堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)、骨橋蛋白(OPN)、Ⅰ型前膠原(Pro-collagenⅠ)、Ⅱ型前膠原(Pro-collagenⅡ)、核心結合因子al(Cbfal)等成骨性標志基因的變化趨勢

4、并確定其誘導成骨的最適濃度；取新生1天的C57BL/6小鼠的顱骨和跖骨作骨組織旋轉培養(yǎng)，應用組織化學染色和四環(huán)素熒光標記檢測其骨量和骨體積變化及新骨形成情況；分別將一定濃度的該化合物溶液注射至健康成年小鼠股后部肌袋內，應用組織化學等技術觀察其體內的異位骨形成情況，以了解小分子化合物OIC-A006的骨誘導性能。 通過Western-blot等技術，檢測BMSCs的Smad4蛋白表達情況；利用RNAi技術，阻遏smad4轉錄，同時

5、檢測OPN在OIC-A006影響下表達情況；克隆含OPN啟動子基因的cDNA片段，構建OPN啟動子/熒光酶素報告基因表達載體系統(tǒng)，轉染載體至293T細胞，在含特定濃度OIC-A006的條件培養(yǎng)液干預下培養(yǎng)，通過檢測熒光酶素活性來確定OPN的表達情況，以了解和驗OIC-A006的骨誘導作用有可能是模擬BMPs的功效并通過BMPs/Smads通路而發(fā)揮的。 制備兔顱骨臨界性骨缺損模型，在缺損處分別植入含一定濃度的OIC-A006的煅

6、燒骨顆粒復合物或單純煅燒骨顆粒。分別于術后4周、8周：應用X-線檢查骨修復進展狀況；應用微CT(μCT)測量骨體積和骨小梁構筑；應用組織化學染色和四環(huán)素標記技術觀測新骨形成情況。綜合比較分析OIC-A006的骨修復復合材料的骨修復性能。 結果： 與非用藥干預組相比，由OIC-A006體外干預培養(yǎng)的BMSCs，MTT法檢測后顯示OIC-A006對細胞增殖未有明顯影響(P＞0.05)。運用RT-PCR技術和Realtime-

7、PCR技術，在含OIC-A006的濃度為3.1μM、6.25μM、12.5μM、25μM的條件培養(yǎng)液干預BMSCs后，與空白對照組相比，ALPmRNA表達隨化合物濃度增高而增加，呈明顯的量效依賴性；而OPN和CbfalmRNA的表達則在化合物濃度為6.25μM時達到最高值。 在含6.25μM濃度的OIC-A006條件培養(yǎng)液干預下，BMSCs成骨標志性基因表達量呈時間依賴性變化，即隨細胞培養(yǎng)時間(5、10、15、20、25天)延長

8、，其成骨標志性基因的表達量增加。通過Realtime-PCR技術檢測，PIC-A006組中ALP、Cbfal、OPN和Pro-CollagenⅠ，ⅡmRNA表達量各個時間點均高于對照組。其中，ALP，Pro-collagenⅠ，Pro-collagenⅡ和OPN培養(yǎng)10，15，20，25天后進行兩組mRNA表達量均具有明顯的統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，而Cbfal則在所有5個時間點上兩組差異明顯，有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。同時，Pr

9、o-collagenⅡmRNA表達在培養(yǎng)的第10天左右達到高峰后逐漸下降，而Pro-collagenⅠ則持續(xù)增高。 在OIC-A006為6.25μM最適濃度培養(yǎng)下，BMSCs生長至20天時，行VonKossa染色和茜素紅染色。OIC-A006組鈣化結節(jié)明顯直徑較大、數(shù)量較多。光鏡下計數(shù)鈣化結節(jié)數(shù)量，OIC-A006組與對照組之間有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；行OPN免疫細胞化學染色，顯示OIC-A006組較對照組棕色顆粒明顯增多

10、，表達增強；行骨鈣素測定(放免法)，顯示OIC-A006組較對照組骨鈣素含量明顯增強，且有明顯統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。 新生小鼠顱蓋骨及跖骨經組織培養(yǎng)后，行組織化學染色和四環(huán)素熒光標記技術可以觀察到與對照組相比，OIC-A006組明顯骨組織增粗，成骨細胞活躍，新骨形成明顯。同時，對新骨形成面積與新骨形成寬度分析也證明兩組具有明顯統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。將OIC-A006注射至小鼠股后部肌袋內，1周后即可以通過組織化學染色

11、發(fā)現(xiàn)有明顯的軟骨和細胞外特異性異染物質形成。 在OIC-A006誘導BMSCs表達成骨表型的過程中，與BMPs/Smad細胞內信號傳導途徑相關的Smad4蛋白表達量明顯增加，這種聯(lián)系通過BMSCs在培養(yǎng)第5、10、15天行Westernblot檢測，當OIC-A006干預細胞培養(yǎng)時，Smald4蛋白表達隨著時間的延長，表達則明顯增加而獲得的(p＜0.05)；當應用RNAi技術將BMSCssmad4基因的表達阻遏后，OIC-A00

12、6對細胞OPNmRNA表達的促進作用明顯受抑，但OIC-A006干預下OPNmRNA表達仍然優(yōu)于單純阻遏smad4后OPN的表達，且兩者具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；同時，通過將OPN啟動子/熒光酶素報告基因表達載體轉染至293T細胞后發(fā)現(xiàn)，在含OIC-A006條件培養(yǎng)液干預下，轉基因的293T細胞OPN啟動子表達增加，且與對照組相比，兩者有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。 應用OIC-A006與煅燒骨復合材料進行顱骨缺損修復的試

13、驗研究。應用X-線技術檢測結果顯示OIC-A006與煅燒骨組成的復合物組較單純煅燒骨組骨缺損區(qū)域骨量增加，骨修復區(qū)域增大，骨修復作用明顯增強。應用微CT(μCT)測量顯示實驗組新生板層骨組織較多，骨小梁較粗大，板層骨8周已經形成一定的有序排列結構。相對于對照組，骨形態(tài)塑性明顯。應用四環(huán)素標記技術顯示OIC-A006組呈現(xiàn)明顯寬大、清晰的金黃色熒光雙標線，提示成骨活躍，表明新生骨組織較對照組明顯增多；而對照組雙標線融合在一起，提示成骨明顯

14、不活躍。 結論： 合成性小分子化合物OIC-A006可誘導小鼠骨髓間充質干細胞表達成骨表型，在體內外呈現(xiàn)明顯的骨誘導活性；OIC-A006透過細胞膜后，其骨誘導作用機制主要發(fā)生二個環(huán)節(jié)： 一是可激活BMP/Smads信號通路中的Smad4、呈現(xiàn)類似BMP的骨誘導特性； 二是可直接觸發(fā)成骨性標志基因OPN啟動子的轉錄；以OIC-A006激動因素，設計與構建的骨修復材料初步表現(xiàn)良好的骨修復性能，并展現(xiàn)出防治骨