1、一、研究背景:
　　抗蛇毒血清是世界衛(wèi)生組織推薦的治療毒蛇咬傷的唯一特效藥物。從世界范圍內看,目前抗蛇毒血清仍然是通過免疫馬或羊等動物來獲得。然而,蛇毒是一種復雜的蛋白質、多肽混合物,其中部分具有很強抗原性的毒素,卻沒有或只有很弱的免疫原性;部分具有很強免疫原性的毒素,卻沒有或只有很弱的抗原性。毒素抗原性和免疫原性的分離,使得目前使用全蛇毒免疫制備的抗蛇毒血清中還存在沒有保護性效價的免疫球蛋白,進一步加重了異源動物蛋白造成了過敏性

2、休克、血清病等嚴重不良反應的發(fā)生。
　　理想的免疫原應該是僅僅包含能夠刺激動物產生有效保護性抗體的致病毒素。
　　尖吻蝮蛇是一種廣泛分布于我國南方地區(qū)的蝰科類毒蛇。其毒性強,毒液量大,受傷患者病情進展快、并發(fā)癥多、預后差,往往面臨截肢或死亡的威脅,是臨床治療中的一大難題。蛇毒金屬蛋白酶(snake venom metalloproteinases SVMPs)目前被認為是尖吻蝮蛇等蝰科類毒蛇毒液中含量最豐富、出血活性最強的致

3、病毒素。AaHⅣ是來源于尖吻蝮蛇毒的出血性P-Ⅲ型 SVMPs,具有完整的金屬蛋白酶結構域(催化結構域)、類去整合素結構域和富含半胱氨酸結構域(非催化結構域),具有明顯的出血活性和抑制血小板聚集活性。
　　二、目的和方法:
　　為了減少免疫毒素的種類、優(yōu)化免疫原結構、減少不良反應發(fā)生率,我們:
　　1)使用親和層析和疏水層析等方法,從尖吻蝮蛇粗毒中純化出天然出血性 P-Ⅲ型 SVMPs AaHⅣ,并將其作為免疫原,同佐

4、劑一起皮下注射免疫小鼠,3輪免疫后通過間接ELISA法檢測抗體效價,確定其是否具有免疫原性;同時,比較使用AaHⅣ免疫小鼠與全蛇毒免疫小鼠產生的抗血清對全蛇毒攻毒的小鼠保護性差異;
　　2)在前部分實驗的基礎上,采用基因工程技術分別合成AaHⅣ催化結構域和非催化結構域cDNA,并分別重組在pET28a(+)質粒上表,通過工程菌E.coli BL21(DE3)誘導表達;表達產物經(jīng)Ni2+-NTA親和層析法進行純化,并分別使用AaHⅣ

5、、催化結構域片段、非催化結構域片段、PBS免疫小鼠,3輪免疫后通過間接 ELLISA法檢測其是否具有免疫原型;同時,比較使用AaHⅣ催化結構域片段、非催化結構域片段免疫小鼠與使用AaHⅣ免疫小鼠產生的抗血清對AaHⅣ攻毒的小鼠保護性差異。
　　三、結果:
　　1、天然AaHⅣ蛋白純化
　　經(jīng)過離子親和層析和疏水層析,以及脫鹽等步驟,成功從江西產尖吻蝮蛇粗毒中純化到出血性P-Ⅲ型SVMP AaHⅣ蛋白,皮下注射昆明小鼠證

6、明其具有出血活性,并通過BLISS法測定其LD50為10.07μg/g。
　　2、AaHⅣ催化結構域和非催化結構域表達及純化
　　根據(jù)Genebank中查詢到的AaHⅣ催化結構域和非催化結構域mRNA序列,進行密碼子最優(yōu)化后,通過基因合成的方法分別獲得 AaHⅣ催化結構域和非催化結構域cDNA,并重組在pET28a(+)表達質粒上。經(jīng)CaCl2法轉入工程菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導分別表達出AaHⅣ催化結構域片段和

7、非催化結構域片段。AaHⅣ催化結構域片段表達形式為包涵體,經(jīng)8mol/L尿素溶液溶解,采用His標簽純化,脫鹽后得到AaHⅣ催化結構域片段;AaHⅣ非催化結構域片段表達形式為可溶蛋白,表達產物經(jīng)Ni2+-NTA親和層析法純化,脫鹽后得到AaHⅣ非催化結構域片段。
　　3、抗體效價:
　　分別使用同批次江西產尖吻蝮蛇毒、AaHⅣ蛋白、AaHⅣ催化結構域片段、AaHⅣ非催化結構域片段、PBS,對昆明小鼠進行腹股溝皮下免疫,首輪免

8、疫使用完全弗氏佐劑,后兩輪免疫使用不完全弗氏佐劑。3輪免疫后1周通過尾靜脈采血,間接ELISA法提示尖吻蝮蛇毒免疫組、AaHⅣ免疫組、AaHⅣ催化結構域片段免疫組、AaHⅣ非催化結構域片段免疫組小鼠均能產生高效價IgG抗體。
　　4、出血抑制實驗:
　　小鼠3輪免疫后摘眼球取血,分離血清,將尖吻蝮蛇毒免疫組、AaHⅣ免疫組和PBS免疫組抗血清分別與尖吻蝮蛇毒混合(5μl:1μg),37℃孵育1小時后注射未免疫小鼠背部皮膚皮下

9、。24小時后測量小鼠皮下出血面積(n=6):AaHIV免疫組為(44.83±19.48)mm2,尖吻蝮蛇毒免疫組為(1.50±3.67)mm2,PBS組為(134.83±21.97) mm2。經(jīng)one way-ANOVA方法進行統(tǒng)計學分析,AaHⅣ免疫組和尖吻蝮蛇毒免疫組皮下出血面積之間有統(tǒng)計學差異(P<0.001),而AaHⅣ免疫組與PBS組之間皮下出血面積也有統(tǒng)計學差異(P=0.001)。
　　小鼠3輪免疫后摘眼球取血,分離血

10、清,將AaHⅣ免疫組、催化結構域免疫組、非催化結構域免疫組和PBS免疫組抗血清分別與新鮮純化的AaHⅣ混合(5μl:1μg),37℃孵育1小時后注射未免疫小鼠背部皮膚皮下。24小時后測量小鼠皮下出血面積(n=6):AaHⅣ免疫組為(2.83±4.92)mm2,催化結構域免疫組為(5.67±6.74)mm2,非催化結構域免疫組為(16.50±11.04)mm2,PBS組為(52.50±16.94)mm2。經(jīng) one way-ANOVA統(tǒng)計

11、學分析,AaHⅣ免疫組、催化結構域免疫組、非催化結構域免疫組均較 PBS組顯著減少出血面積(P<0.001);AaHⅣ免疫組與催化結構域免疫組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),而與非催化結構域免疫組之間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05);
　　5、攻毒實驗:
　　新鮮配置的尖吻蝮蛇毒溶液2LD50劑量采用腹腔注射的方法對尖吻蝮蛇毒組小鼠、AaHⅣ組小鼠和PBS組小鼠進行攻毒。24小時后AaHⅣ免疫組死亡3只,尖吻蝮蛇毒免疫組死亡

12、1只,PBS組全部死亡(n=10)。Fisher’s Exact test方法統(tǒng)計分析提示,尖吻蝮蛇毒免疫組和AaHⅣ免疫組小鼠死亡率沒有統(tǒng)計學差異(p=0.58)。尖吻蝮蛇毒免疫組和AaHⅣ免疫組小鼠均與PBS組之間存在統(tǒng)計學差異(p<0.01)。
　　新鮮純化的AaHⅣ蛋白2LD50劑量采用腹腔注射的方法對AaHⅣ、AaHⅣ催化結構域片段和非催化結構域片段和PBS組小鼠進行攻毒。24小時后AaHⅣ免疫組存活9只,催化結構域片段

13、免疫組存活8只,非催化結構域片段免疫組存活2只,PBS組存活0只(n=10)。AaHⅣ免疫組和催化結構域片段免疫組小鼠死亡率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。催化結構域片段免疫組和非催化結構域片段免疫組之間(p<0.05),非催化結構域片段免疫組與AaHⅣ免疫組之間(P<0.001)均存在統(tǒng)計學差異。
　　四、結論:
　?、貯aHⅣ具有免疫原性和抗原性,其免疫小鼠產生的抗體能夠具備對尖吻蝮蛇粗毒的中和活性,可以作為制備抗蛇毒血清