1、氧化應激(oxidative stress)是機體最常見的一類應激反應。在一些損傷因素的作用下，細胞內(nèi)氧化代謝物增加，或細胞中抗氧化保護機制不足時，使活性氧產(chǎn)生堆積并對細胞產(chǎn)生毒性，從而產(chǎn)生氧化應激。氧化應激或者氧自由基的產(chǎn)生已被認為是DNA損傷的主要原因之一，可導致一系列的疾病包括癌癥和慢性血管性疾病。堿基切除修復(base excision repair，BER)是氧化應激引起的主要的DNA損傷修復的形式之一，胞內(nèi)堆積的自由基攻擊D

2、NA造成損傷，從而引起了堿基切除修復信號通路的激活。 JWA(GenBank：AFO70523，1 998)是周建偉等從培養(yǎng)的原代人氣管和支氣管上皮細胞中分離并克隆的，受ATRA誘導的新的細胞骨架樣基因。本課題組多年來一直圍繞JWA基因的結構、功能及其相互關系開展研究工作，取得了一系列原創(chuàng)性有意義的研究成果。先后證實JWA是一種新的微管相關蛋白(microtubule-associated protein，MAP)，不僅參與全反

3、式維甲酸(ATRA)誘導的細胞分化調(diào)節(jié)，而且與多種細胞分化、凋亡誘導劑(如TPA，4HPR和AS<,2>O<,3>等)的生物學作用有關，涉及相應的信號通路，而且活躍地參與細胞對應激刺激(如冷應激和熱應激)的應答。近年來許多JWA的同源基因被報道發(fā)現(xiàn)。Ingley等發(fā)現(xiàn)了第一個與JWA同源的基因ARL-6(AF133912)，兩者氨基酸序列同源性達93％，提示JWA與ARL-6可能有相似或相近的生物學功能，而該基因的作用主要涉及PARP與

4、DNA損傷和修復。本研究主要應用氧化應激模型、堿基切除修復模型和多種分子細胞生物學實驗技術探討JWA參與氧化應激的機制，JWA參與堿基切除修復信號通途的調(diào)控規(guī)律，其與堿基切除修復蛋白之間的關系；初步明確JWA在細胞應答氧化應激中發(fā)揮的具體作用，構建以JWA參與堿基切除修復過程為核心的信號轉導通路；為最終闡明并完善細胞氧化應激和堿基切除修復信號通路提供新的視角。 一、胞內(nèi)H<,2>O<,2>誘導JWA應答氧化應激 選取經(jīng)典

5、的氧化應激誘導劑H<,2>O<,2>和B(a)P處理NIH-3T3和HELF細胞，隨著處理時間的延長JWA表達逐漸增加，有明顯的時間依賴效應。為了探究何種氧自由基誘導了JWA的表達，我們將SOD(O<,2><'->·的拮抗劑)和過氧化氫酶catalase(胞內(nèi)H<,2>O<,2>的拮抗劑)應用于H<,2>O<,2>和B(a)P誘導的氧化應激模型中，結果顯示在NHt-3T3細胞中用SOD處理后JWA表達無變化，而用catalase處理后原

6、本被H<,2>O<,2>和B(a)P誘導表達增加的JWA表達明顯下降，說明胞內(nèi)H<,2>O<,2>誘導JWA應答氧化應激。 二、核因子NFI調(diào)控JWA應答氧化應激 構建了JWA啟動子區(qū)域的系列報告基因質粒，利用報告基因試驗我們發(fā)現(xiàn)-107/+107的啟動子區(qū)對氧化應激的誘導最為敏感。采用膠泳動率遷移實驗(EMSA)證實有核蛋白和-107/-28啟動子區(qū)域結合。為了進一步揭示此核蛋白的身份，用Souchwestern實驗證

7、實此核蛋白的分子量為47kD左右。最后用EMSA的超遷移實驗(supershift)和RNA干涉實驗證實該核蛋白是NFI。由于NFI的結合基序是CCAAT，而JWA-107/-28啟動子區(qū)包含2個CCAAT反應元件，為了確定NFI與JWA近端啟動子區(qū)哪一個CCAAT結合，我們用Southwestern、EMSA、定點突變和報告基因實驗證實了核因子NFI與JWA近端啟動子區(qū)的第二個CCAAT、結合從而調(diào)控JWA應答氧化應激。 三、

8、JWA保護氧化應激所誘導的DNA單鏈損傷 成功構建了JWA低表達的細胞株，采用堿性彗星實驗檢測兩種細胞對于氧化應激誘導下的DNA損傷情況。結果發(fā)現(xiàn)在B(a)P誘導的過程中，JWA低表達的細胞較之對照細胞DNA損傷程度更加嚴重，并且修復的時間延長，說明JWA保護氧化應激所誘導的DNA單鏈損傷。 四、JWA與堿基切除修復蛋白XRCCl和PARP1相互作用 由于JWA能夠保護氧化應激引起的DNA損傷，我們推測JWA可能

9、是直接或間接參與了某個修復通路，而氧化應激引起的主要的修復途徑是堿基切除修復，并且堿基切除修復通路中最重要的信號分子是XRCC1和PARP1。分別用H<,2>O<,2>和B(a)P處理質粒對照NIH-3T3細胞和JWA缺陷型NIH-3T3細胞。在JWA蛋白表達正常的細胞中氧化應激均能誘導JWA與XRCCl的表達增加，PARP1的表達明顯降低；而在JWA蛋白表達缺陷的細胞中，氧化應激不能誘導XRCC1的表達變化，但是PARP1的表達明顯增

10、加。為了進一步研究JWA與XRCCI在氧化應激誘導的堿基切除修復中的關系，采用回復模型，即將JWA高表達的質粒轉染到JWA低表達的細胞中，使得JWA的蛋白表達水平恢復正常，然后再用H<,2>O<,2>和B(a)P處理細胞，觀察JWA蛋白表達的變化對XRCC1和PARP1的影響。結果顯示，當采用JWAcDNApEGFP質粒轉染JWA缺陷型細胞，回復JWA蛋白的正常表達后，氧化應激又能誘導JWA與XRCC1的表達增加，而PARP1的表達明顯

11、降低。之后，進一步用免疫沉淀和免疫熒光實驗證實了JWA與XRCC1在NIIt-3T3細胞中共定位。說明在氧化應激誘導的堿基切除修復通路中，JWA與堿基切除修復蛋白XRCC1相互結合并且表達一致，而負調(diào)控PARP1的表達。 五、JWA在堿基切除修復信號通路中的定位 分別用H<,2>O<,2>和B(a)P處理質粒對照NIH-3T3細胞和JWA缺陷型NIH-3T3細胞。采用免疫印跡實驗檢測識別蛋白APE1和縫合蛋白Lig Ⅲ的

12、表達。結果顯示，在JWA蛋白表達正常的細胞中氧化應激均能誘導JWA與Lig Ⅲ的表達增加，而在JWA蛋白表達缺陷的細胞中，氧化應激不能誘導Lig Ⅲ的表達變化；但是JWA對APE1的表達沒有任何的影響。說明在氧化應激過程JWA參與調(diào)控Lig Ⅲ(損傷位點修復縫合蛋白)而對APE1(損傷位點識別蛋白)無影響。進一步說明在堿基切除修復信號通路中JWA參與了損傷位點的修復和縫合過程而不參與損傷位點的識別過程。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在氧