1、研究背景和目的
　　 肝細胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，并且死亡率非常高，其原因一方面因為肝癌的生物學行為，另一方面因為缺乏早期診斷，而已有的AFP在肝癌診斷上只有60％左右的陽性率。如果能找到相對肝癌特異的蛋白或基因，將會對研究肝癌的發(fā)病機制以及提高早期診斷有重要的意義。目前研究發(fā)現人類癌抗原(Human Carcinoma Antigen，HCA)作為一種糖蛋白

2、復合物在癌癥中廣泛表達，其蛋白成分具有腫瘤相對特異性。尋找特異性的肝癌相關的HCA分子為提高原發(fā)性肝癌的早期檢出率以及了解HCC的生物學行為和靶向治療提供了新線索和新依據。
　　 應用免疫沉淀聯合質譜技術鑒定出細胞骨架相關膜蛋白4(cytoskeleton-associated membrane protein CKAP4)是HCA的一個組成成分。CKAP4，又稱P63，細胞骨架相關膜蛋白4(CKAP4)，分子量63KD，是一種

3、Ⅱ型跨膜蛋白，連接于內質網與微管之間。其由氨基端106個氨基酸的細胞溶質尾，跨膜區(qū)以及羧基端474個氨基酸的細胞漿區(qū)組成。早期研究表明CKAP4對維持內質網結構具有重要的作用。最近被鑒定為組織纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)，表面活性蛋白A(SP-A)，以及抗增生因子(anti-proliferative factor，APF)的細胞表面受體。其中已有研究表明CKAP4-與APF結合可以抑制膀胱癌細胞的增殖，其作用機制可能和Wnt信號通

4、路相關。而Wnt信號通路是眾多組織中調控細胞增殖、凋亡和分化的重要通路。因而探討CKAP4在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要的臨床價值。
　　 目前有關CKAP4在肝癌細胞表達情況以及在肝癌發(fā)生發(fā)展中處于何種地位尚無文獻報道。本研究的目的一方面研究CKAP4在肝癌中的表達情況并結合臨床資料探討其表達與肝癌發(fā)生發(fā)展的關系；另一方面研究CKAP4在肝癌中的生物學作用及機制；最后將研究CKAP4血清學檢測診斷肝癌的應用價值。從而有助于了解

5、肝癌的生物學行為及為可能的靶向治療和診斷提供實驗和理論依據。
　　 實驗方法
　　 1.運用real-time PCR、western blot以及IHC等方法檢測肝癌、癌旁及正常肝組織中CKAP4的表達情況；
　　 2.IHC方法檢測大鼠DEN誘癌過程中CKAP4在肝臟中表達的動態(tài)變化過程；
　　 3.結合臨床資料統(tǒng)計分析CKAP4與相關臨床指標及預后之間的關系；
　　 4.構建CKAP4高低表

6、達的質粒并建立穩(wěn)定轉染空載體、高表達CKAP4及穩(wěn)定干擾CKAP4的肝癌細胞系：WRL68-VT、WRL68-OV；7721-VT、7721-OV、7721-KD，用real-time PCR和western blot鑒定高低表達效果；
　　 5.采用CCK-8檢測CKAP4高低表達對多種細胞系增殖的影響；
　　 6.用western blot檢測在TNFα和CHX或DTT刺激下CKAP4高低表達對細胞凋亡的影響；

7、>　　 7.CKAP4高低表達穩(wěn)轉細胞系經EGF刺激后，通過real-time PCR和western blot檢測Wnt信號通路和EMT相關的蛋白的變化；
　　 8.擴增CKAP4高低表達穩(wěn)轉細胞系行裸鼠皮下荷瘤，觀察腫瘤生長情況。并用real-time PCR、western blot以及IHC等方法對腫瘤組織分析；
　　 9.通過ELISA檢測大鼠DEN誘癌過程中血清中CKAP4的動態(tài)變化，及比較正常、肝炎、肝硬

8、化及肝癌病人血清中CKAP4的表達；
　　 結果
　　 1.CKAP4在肝癌組織中高表達：
　　 ①基因轉錄水平和蛋白表達水平顯示CKAP4在肝癌組織中表達明顯高于癌旁組織和正常組織；
　　 ②IHC結果根據著色強度和著色面積評分顯示肝癌組織評分結果明顯高于癌旁組織和正常組織的評分結果，并具有統(tǒng)計學意義；以正常組織的著色情況為基準分為高表達組(61％)和低表達組(39％)。
　　 2.在大鼠DEN

9、誘癌過程中，CKAP4在肝臟中的表達逐漸升高：IHC顯示實驗組隨著時間延長CKAP4表達越來越高，在10W時實驗組明顯高于對照組，而對照組CKAP4表達無明顯變化。
　　 3.臨床資料統(tǒng)計分析：
　　 ①卡方檢驗顯示CKAP4表達和腫瘤大小、肝內轉移、門靜脈侵犯、BCLC分期成負相關；
　　 ②CKAP4表達和生存時間和無瘤生存時間呈正相關并具有統(tǒng)計學意義。
　　 4.CKAP4高低表達對肝癌細胞的影響：

10、
　　 ①CKAP4過表達抑制細胞的增殖和促進細胞的凋亡，干擾掉促進細胞的增殖和抑制細胞的凋亡；
　　 ②CKAP4過表達后抑制細胞的遷移和克隆形成能力，和對照組相比具有統(tǒng)計學意義；
　　 5.相關機制研究：抑制Wnt信號轉導通路和EMT的發(fā)生
　　 ①在EGF刺激下，和對照組相比CKAP4過表達可抑制GSK3β、AKT、JNK、ERK的磷酸化能力；在蛋白水平和基因轉錄水平抑制β-catenin、c-My

11、c和cyclinD1的表達。
　　 ②在EGF刺激下，和對照組相比CKAP4過表達在蛋白水平和基因轉錄水平抑制snail、vimentin的表達，促進E-cadherine、ZO-1的表達。
　　 6.裸鼠荷瘤實驗：
　　 ①皮下腫瘤大?。焊蓴_CKAP4后腫瘤較對照組大，過表達組腫瘤最小。
　　 ②腫瘤組織分析顯示CKAP4過表達可抑制Wnt信號轉導通路相關蛋白的表達及抑制EMT的發(fā)生，和體外實驗結果一致

12、。
　　 7.CKAP4在肝癌患者血清中的濃度較正常人高：
　　 ①ELISA檢測在大鼠DEN誘癌過程血清中CKAP4濃度變化，結果顯示從8W開始CKAP4濃度明顯高于正常，到14w時CKAP4濃度達到最高，并有統(tǒng)計學意義。
　　 ②ELISA結果顯示肝炎、肝硬化、肝癌病人血清中CKAP4濃度明顯高于正常人，其中肝炎、肝癌與正常相比具有統(tǒng)計學意義；
　　 結論
　　 本研究發(fā)現CKAP4在肝癌組織

13、中高表達，與腫瘤大小、肝內轉移、門脈侵犯及BCLC分期密切相關。單因素分析CKAP4是OS和DFS的獨立風險因素，多因素分析CKAP4是OS的風險因素，有望作為評估肝癌預后的一項有前景的指標。進一步體內和體外實驗研究表明CKAP4在肝癌發(fā)生過程中起抑制作用，其可能通過抑制Wnt信號通路和EMT的發(fā)生發(fā)揮其生物學作用。另外，CKAP4在肝癌血清中濃度高于正常，ROC曲線分析CKAP4作為肝癌的診斷指標和AFP比較效能偏低，但是在AFP<1