1、本文主要從以下幾個方面展開論述：
　　第一部分 星形細胞對膠質瘤耐藥性的影響及機制研究
　　背景：膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是中樞神經系統中最常見且最致命的原發(fā)性腫瘤，因其浸潤生長的特點，手術完全切除十分困難。雖然手術聯合放療和化療能增加GBM患者生存期，但其預后仍差，復發(fā)率高，中位生存期僅為14.6個月。相關研究顯示，膠質瘤對化療藥物的耐受性是患者術后復發(fā)、生存期縮短的重要原因之一。替莫唑胺(temo

2、zolomide，TMZ)和長春新堿(vincristine，VCR)是臨床上常用的、用于治療膠質瘤的兩種不同機制的抗腫瘤藥物，雖然在體外實驗中能有效的殺傷腫瘤細胞，但因耐藥性的存在，其臨床效果不佳。因此，尋找逆轉膠質瘤耐藥性的新策略或增強化療藥物的敏感性，對膠質瘤治療十分重要，也是目前臨床試驗的重點。
　　目的：本實驗檢測星形細胞是否影響膠質瘤細胞對化療藥物的敏感性，探討星形細胞影響膠質瘤耐藥性的內在機制，深入理解腫瘤微環(huán)境對膠

3、質瘤耐藥性的影響，從而為膠質瘤耐藥性新治療靶點的發(fā)現、尋找更為有效的控制腫瘤的策略、提高膠質瘤治療療效提供理論和實驗依據。
　　方法和結果：1.人星形細胞通過與膠質瘤細胞直接接觸降低其對化療藥物的敏感性
　　為檢測星形細胞對膠質瘤耐藥性的影響，我們建立星形細胞和CFSE標記的膠質瘤細胞的共培養(yǎng)模型，應用AnnexinⅤ/PI方法檢測膠質瘤細胞的凋亡水平。實驗結果顯示:與人星形細胞共培養(yǎng)后，膠質瘤細胞系A172的凋亡比例下降約

4、50％，提示星形細胞能降低膠質瘤細胞對化療藥物TMZ和VCR的敏感性。
　　為檢測星形細胞是通過與膠質瘤細胞直接接觸還是通過分泌細胞因子發(fā)揮化療保護作用，我們建立直接接觸和transwell間接共培養(yǎng)模型。結果顯示，星形細胞的化療保護作用依賴于星形細胞與膠質瘤細胞之間的直接接觸。
　　2.星形細胞通過與膠質瘤細胞形成縫隙連接通道（gap junctionalcommunication，GJC）提高膠質瘤細胞的耐藥性
　

5、　縫隙連接通道(GJC)是細胞間直接接觸形成一個重要結構，在腫瘤細胞的凋亡和死亡過程中發(fā)揮重要作用。本實驗通過dye transfer實驗，檢測星形細胞與膠質瘤細胞間是否存在通過GJC的物質交換;通過加入GJC阻斷劑CBX，檢測星形細胞與膠質瘤細胞間形成的GJC對膠質瘤耐藥性的影響。
　　實驗結果顯示，星形細胞與膠質瘤細胞間存在通過GJC的小分子物質交換，而且該過程可被CBX阻斷;在直接接觸共培養(yǎng)組中加入CBX阻斷星形細胞與膠質瘤

6、細胞間的GJC，能逆轉星形細胞對膠質瘤的化療保護作用，提示星形細胞通過與膠質瘤形成GJC提高膠質瘤細胞的耐藥性。
　　3.GJC介導的星形細胞對膠質瘤的化療保護作用依賴于連接蛋白43(connexin43，Cx43)
　　在中樞神經系統和膠質瘤中，連接蛋白43(Cx43)是構成GJ的主要蛋白。我們通過細胞免疫熒光實驗檢測星形細胞和膠質瘤細胞Cx43的表達情況;通過小干擾RNA技術敲低A172細胞Cx43表達后與星形細胞進行d

7、ye transfer實驗和共培養(yǎng)凋亡實驗，檢測Cx43對這兩種細胞間物質交換和凋亡的影響。
　　實驗結果顯示，星形細胞和膠質瘤細胞均表達Cx43，兩種細胞間可形成GJC;將膠質瘤細胞敲低Cx43后與星形細胞共培養(yǎng)，其染料傳遞比例明顯下降，并且與CBX組相比無顯著性差異，提示Cx43可能是構成星形細胞與膠質瘤細胞間功能性GJC的主要蛋白。同時流式結果顯示，共培養(yǎng)組中轉染siCx43的膠質瘤細胞的凋亡水平與單獨培養(yǎng)組相比，無顯著性差

8、異，并且加入CBX不顯著影響其凋亡水平。以上結果提示GJC介導的星形細胞對膠質瘤的化療保護作用是依賴于Cx43的。
　　4.星形細胞通過GJC調控膠質瘤細胞內Ca2+濃度、防止鈣超載，降低膠質瘤細胞對化療藥物的敏感性
　　鈣離子是可通過GJ在細胞間進行傳遞的重要的第二信使，在激活和執(zhí)行細胞凋亡和死亡中起關鍵作用。我們通過Fluo-3AM標記法，用流式細胞技術檢測各實驗組細胞內鈣離子濃度及變化，驗證Ca+在星形細胞調控膠質瘤細

9、胞凋亡中起關鍵作用。
　　實驗結果顯示，膠質瘤細胞的Ca2+濃度隨細胞凋亡的升高而升高，并且加入Ca2+螯合劑BAPTA能降低化療藥物誘導的細胞凋亡;星形細胞內的Ca2+濃度要顯著低于A172單獨培養(yǎng)組;與星形細胞共培養(yǎng)后，A172細胞內Ca2+濃度降低，共培養(yǎng)組細胞內Ca2+濃度聚集速度要顯著慢于單獨培養(yǎng)組，并且該過程可被CBX阻斷。以上結果提示，在化療藥物作用下，星形細胞和膠質瘤細胞內的Ca2+濃度不平衡，可能存在通過GJC的

10、Ca2+流。因此，星形細胞可能通過GJC調控膠質瘤細胞內Ca2+濃度，防止鈣超載，抑制膠質瘤細胞的凋亡。
　　結論：1.腫瘤微環(huán)境中的星形細胞能降低膠質瘤細胞對化療藥物TMZ和VCR的敏感性。
　　2.星形細胞通過與膠質瘤細胞直接接觸形成GJC，調控膠質瘤細胞內Ca2+濃度，防止鈣超載，降低膠質瘤細胞的凋亡。
　　3.星形細胞與膠質瘤細胞間的GJC依賴于Cx43。
　　4.星形細胞與膠質瘤細胞間存在相互作用，臨床

11、應用化療藥物治療膠質瘤時應考慮星形細胞的影響，可聯合應用GJC阻斷劑CBX，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。
　　5.星形細胞與膠質瘤細胞間的Cx43—GJC可作為膠質瘤耐藥性治療的新靶點。
　　第二部分 星形細胞對膠質瘤遷移和侵襲的影響及其機制研究
　　背景：膠質瘤的侵襲特性，使手術完全切除十分困難并介導對目前治療手段的耐受性，是膠質瘤患者預后差的主要原因。因此，制定新策略治療膠質瘤的侵襲特性或深入理解調控膠質瘤侵襲

12、的機制，對膠質瘤的治療極為關鍵。
　　越來越多的研究顯示，腫瘤微環(huán)境尤其是腫瘤基質細胞影響腫瘤的惡性生物學行為。而星形細胞是人腦中數目最多的膠質細胞，是膠質瘤微環(huán)境中重要的基質細胞群。有研究顯示，星形細胞能增強膠質母干樣細胞的侵襲能力，并在腫瘤的生長、血管生成中起重要作用。此外，星形細胞還能通過分泌大量細胞因子影響腫瘤的增殖和侵襲能力。膠質瘤微環(huán)境中的另一種基質細胞——小膠質細胞，影響膠質瘤侵襲的機制已經得到深入闡述，但星形細胞對

13、膠質瘤侵襲的影響及機制研究仍較少。
　　MMP14是MMP家族的一種跨膜蛋白，能通過裂解膜表面糖蛋白CD44或通過與TIMP-2結合為復合物進而激活MMP2或MMP9，促進腫瘤的遷移和侵襲。研究顯示，多種侵襲性腫瘤和基質細胞的MMP14表達上調，并且小膠質細胞或膠質瘤細胞的MMP14逐漸成為膠質瘤治療的新靶點。IL-6是一種調節(jié)免疫和炎癥反應的細胞因子。近年來有研究顯示，IL-6能通過增強MMP2和MMP9的活性促進膠質瘤的遷移和

14、侵襲，因此，IL-6可能通過影響MMP14的活性或表達來調控MMP2或MMP9的活性?；谝陨涎芯?，我們提出:星形細胞能通過分泌大量細胞因子如IL-6來調控膠質瘤細胞MMP14的表達，進而影響腫瘤的遷移和侵襲能力。
　　目的：本實驗的目的是通過研究腫瘤微環(huán)境中的星形細胞對膠質瘤遷移和侵襲特性的影響，深入探究星形細胞促進膠質瘤遷移和侵襲的機制，為膠質瘤的臨床治療，尤其是對其侵襲特性的治療，提供新的治療靶點和實驗依據。
　　方法

15、和結果：1.人星形細胞提高膠質瘤的遷移和侵襲能力
　　通過transwell遷移和侵襲實驗，檢測星形細胞對膠質瘤遷移和侵襲特性的影響。結果顯示，人星形細胞能通過分泌細胞因子顯著提高膠質瘤細胞系U251和A172的遷移和侵襲能力。
　　2.星形細胞通過分泌細胞因子上調遷移和侵襲相關的基因和蛋白并激活相關信號通路
　　用星形細胞培養(yǎng)上清(ACM)分別刺激膠質瘤細胞系U251和A172，qRT-PCR或Western blo

16、t方法檢測并篩選遷移和侵襲相關基因和蛋白如MMP和Rho家族，結果顯示MMP14表達上調最為顯著;檢測遷移和侵襲相關信號通路，發(fā)現ERK1/2、AKT和p38MAPK信號通路被激活。
　　3.星形細胞上清能誘導膠質瘤細胞膜表面MMP14的表達，并通過激活MMP2而不是裂解CD44，促進膠質瘤的遷移和侵襲
　　用星形細胞培養(yǎng)上清刺激膠質瘤細胞，通過流式細胞技術檢測膜蛋白的表達情況，發(fā)現膠質瘤細胞膜表面MMP14表達上升，而CD

17、44沒有變化。用小干擾RNA技術下調膠質瘤細胞MMP14的表達，明膠酶譜實驗顯示其分泌的MMP2活性降低，transwell遷移和侵襲實驗顯示其遷移、侵襲能力明顯下降;而用ACM上調膠質瘤細胞膜表面MMP14表達后，其分泌的MMP2活性上升。以上結果提示星形細胞能通過分泌細胞因子上調膠質瘤細胞膜表面MMP14的表達，進而通過激活MMP2而不是裂解CD44促進膠質瘤的遷移和侵襲能力。
　　結論：1.星形細胞通過分泌細胞因子上調膠質瘤