1、原發(fā)性肝細胞肝癌(HCC)是世界范圍內(nèi)第五大常見腫瘤，也是我國常見的消化系統(tǒng)腫瘤。并且有著進展快、術(shù)后復發(fā)率高以及預后不良的特點。原發(fā)性肝細胞肝癌的易于成血管性是導致其預后不良的最主要因素之一。這種生物學特性使腫瘤更易于擴散，導致毗鄰臟器浸潤和遠處臟器的轉(zhuǎn)移。從一定程度上講，原發(fā)性肝細胞肝癌這種術(shù)后易復發(fā)的特點給傳統(tǒng)的放化療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。所以，有必要通過確認新的標記物來篩選出那些行根治性切除術(shù)后易復發(fā)的患者。對他們再次行有效的輔助治

2、療，這樣能夠更好的提高原發(fā)性肝細胞肝癌的根治效果，改善患者預后。
　　 癌胚抗原相關(guān)細胞粘附分子1(CEACAM1)是癌胚抗原(CEA)超家族成員。在一些免疫細胞及上皮細胞中均可以檢測到CEACAM1的表達。過去的研究發(fā)現(xiàn)，就腫瘤細胞的生長和進展而言，CEACAM1在不同的惡性腫瘤類型中發(fā)揮著不同的作用。比如，相比正常組織，CEACAM1在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌以及子宮內(nèi)膜癌組織中表達明顯減少。已有的文獻證實，在乳腺癌和前列腺

3、癌組織中，CEACAM1對腫瘤細胞的生長起著負調(diào)節(jié)作用，也就是說在這兩種類型的惡性腫瘤中CEACAM1發(fā)揮著抑癌作用。相反的，在正常的肺組織、肺細胞和黑色素細胞中鮮有CEACAM1的表達，而在肺腺癌和黑色素瘤中CEACAM1的表達似乎可以促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，提示腫瘤預后不良。以往的文獻報道發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性肝癌細胞中CEACAM1表達水平降低，而CEACAM1在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達缺失提示了腫瘤的不良預后。近期的研究發(fā)現(xiàn)，在口

4、腔癌組織中，CEACAM1分為細胞膜表達和細胞漿表達兩種類型，而CEACAM1不同的表達類型在腫瘤的微血管生成和微淋巴管生成中發(fā)揮著不同的作用。目前來講，并沒有關(guān)于不同類型的CEACAM1在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中表達的文獻報道。其不同表達類型是否也像口腔癌中的CEACAM1一樣在腫瘤的進展、血管生成以及預后中發(fā)揮了不同的作用，更不得而知。
　　 對于可溶性CEACAM1的研究，目前報道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，在健康人外周血清中可檢測到

5、可溶性CEACAM1的存在。而在膽管性疾病患者外周血清中，則發(fā)現(xiàn)可溶性CEACAM1的水平明顯增高，這包括原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎以及膽管上皮癌。另外最近的研究發(fā)現(xiàn)，相比健康人群，在胰腺癌患者血清中的CEACAM1的表達水平明顯增高，并且其似乎可以作為診斷胰腺癌的一個潛在腫瘤標記物。Markel等人在黑色素瘤患者的研究中同樣發(fā)現(xiàn)這種可溶性的CEACAM1在患者血清中的表達水平明顯增高。雖然一些研究者對血清中可溶性CEACAM1

6、做了一些前期研究。但就目前來講，對人血清中可溶性CEACAM1的量化仍然沒有一個統(tǒng)一的檢測標準。另外，對于血清中這種可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細胞肝癌中的表達未見有報道，其在原發(fā)性肝細胞肝癌中起到怎樣的作用也不得而知，這些都需要進一步的深入研究。
　　 第一部分：CEACAM1在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達及其意義
　　 研究目的:
　　 本部分主要研究癌胚抗原相關(guān)細胞粘附分子1(CEACAM1)在原發(fā)性肝細

7、胞肝癌中的表達方式。分析不同的表達方式與不同臨床病理指標之間的相關(guān)性，以及不同表達方式和腫瘤微血管生成以及和原發(fā)性肝癌切除術(shù)后預后之間的關(guān)系。
　　 研究方法:
　　 山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會批準這個研究協(xié)議。獲取山東大學齊魯醫(yī)院普外科97例原發(fā)性肝細胞肝癌患者腫瘤標本。
　　 1.CEACAM1和CD34在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達檢測:獲取原發(fā)性肝細胞肝癌標本，制備蠟塊后切片，免疫組化法檢測CEACAM1

8、以及CD34在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達。
　　 2.原發(fā)性肝細胞肝癌組織中不同表達類型的CEACAM1和患者臨床病理指標之間的相關(guān)性分析:采用Chi-square檢驗對CEACAM1不同表達類型各亞組與患者臨床病理資料之間進行比較，分析其相關(guān)性。
　　 3.原發(fā)性肝細胞肝癌組織中不同表達類型的CEACAM1對原發(fā)性肝癌患者根治性切除術(shù)后預后的影響分析:采用Kaplan-Meier分析繪制生存曲線，Log-rank檢驗

9、用于分析原發(fā)性肝細胞肝癌組織中不同類型CEACAM1表達對原發(fā)性肝癌患者根治術(shù)后無瘤生存期的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.在97例原發(fā)性肝細胞肝癌的腫瘤標本中有91例標本檢測到CEACAM1的表達。其中53例為細胞膜表達，38例為細胞漿表達。
　　 2.在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中CEACAM1表達類型與原發(fā)性肝癌的腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤有無血管侵犯、腫瘤有無衛(wèi)星灶存在、Edmondson-Steiner分級、T

10、NM分級以及腫瘤微血管密度(MVD，以CD34表示)密切相關(guān)(p＜0.05)，而與患者性別、年齡、血清HBsAg陰陽性、血清抗HCV抗體陰陽性、是否存在肝硬化、血清ALT水平、血清AST水平、血清GGT水平等無明顯相關(guān)性(p＞0.05)。
　　 3.腫瘤標本為肝癌細胞漿型CEACAM1表達的原發(fā)性肝癌患者3年無瘤生存期(中位生存期=21.5月，3年無瘤生存率26.3％)明顯低于標本為細胞膜型CEACAM1表達的患者(中位生存期=

11、36月，3年無瘤生存率52.8％)(p=0.005)。多因素分析結(jié)果顯示:CEACAM1胞漿表達可以作為判斷原發(fā)性肝癌術(shù)后復發(fā)的獨立因素(p=0.031)。
　　 結(jié)論:
　　 1.原發(fā)性肝細胞肝癌組織中CEACAM1的表達存在肝癌細胞漿型和肝癌細胞膜型兩種表達形式。
　　 2.原發(fā)性肝細胞肝癌組織中CEACAM1細胞漿表達和腫瘤進展、腫瘤微血管生成以及患者預后不良相關(guān)。
　　 3.原發(fā)性肝細胞肝癌組織中

12、CEACAM1細胞漿表達可以作為預示原發(fā)性肝癌易于復發(fā)的一個指標。并且將來有可能作為原發(fā)性肝癌切除術(shù)后后續(xù)抑制腫瘤新生血管生成治療的一個新型潛在靶點。
　　 第二部分：可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細胞肝癌患者血清中的表達及其意義
　　 研究目的:
　　 研究可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細胞肝癌患者血清中的表達及其與患者臨床病理指標之間的關(guān)系。探討可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝癌患者中表達的可能作用。
　

13、　 研究方法:
　　 山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會批準這個研究協(xié)議。獲取50例健康自愿者及山東大學齊魯醫(yī)院普外科124例原發(fā)性肝細胞肝癌患者外周血血清;獲取其中26例原發(fā)性肝癌患者腫瘤標本。所有患者及健康自愿者均簽訂書面贊同協(xié)議，研究協(xié)議遵守赫爾辛基宣言。
　　 1.可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細胞肝癌患者及健康人血清中的表達檢測:獲取健康自愿者及原發(fā)性肝癌病人外周血，制備血清。ELISA法檢測血清中可溶性CEACAM

14、1的表達。
　　 2.原發(fā)性肝細胞肝癌患者血清中可溶性CEACAM1的表達水平與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析:采用Chi-square檢驗對原發(fā)性肝細胞肝癌患者血清中可溶性CEACAM1的表達水平與患者臨床病理資料之間進行統(tǒng)計學比較，分析其相關(guān)性。
　　 3.CD34在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達檢測:獲取原發(fā)性肝細胞肝癌標本，制備蠟塊后切片，免疫組化法檢測CD34在原發(fā)性肝細胞肝癌組織中的表達。并將其代表的腫瘤微血管密度(M

15、VD)與相應患者血清可溶性CEACAM1的表達水平做相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.與健康人相比，可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝細胞肝癌患者血清中的表達水平明顯升高(p＜0.05)。
　　 2.在原發(fā)性肝細胞肝癌患者血清中，可溶性CEACAM1表達水平和患者血清HBsAg陰陽性、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、TNM分期、腫瘤有無血管侵犯以及腫瘤微血管密度(MVD，以CD34表示)密切相關(guān)(p＜0.05)。而與患者年齡

16、、性別、有無肝硬化表現(xiàn)、血清抗HCV抗體陰陽性、血清AFP水平、血清ALT水平、血清AST水平、血清GGT水平以及乙肝病毒DNA定量無明顯相關(guān)性(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在健康人群及原發(fā)性肝細胞肝癌患者血清中均存在可溶性CEACAM1，而可溶性CEACAM1在原發(fā)性肝癌患者血清中的水平明顯增高。
　　 2.原發(fā)性肝細胞肝癌患者血清可溶性CEACAM1表達水平的增高促進了腫瘤的進展、增強了腫瘤的侵

17、襲性，而這些可能與可溶性CEACAM1促進腫瘤微血管生成有關(guān)。
　　 第三部分：可溶性CEACAM1在成血管中的作用及其機制
　　 研究目的:
　　 研究可溶性CEACAM1在體外血管生成中的作用及其機制。
　　 研究方法:
　　 1.肝癌細胞株HepG2.2.15細胞(轉(zhuǎn)染了2段完整肝炎病毒的HepG2肝癌細胞)和HepG2細胞(無肝炎病毒轉(zhuǎn)染的肝癌細胞)無菌上清制備:5×105個細胞接種于10

18、0ml培養(yǎng)瓶，細胞達到60％-80％融合后更新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，收取上清，每瓶4ml，分裝凍于-80℃保存。
　　 2.肝癌細胞株HepG2.2.15和HepG2細胞CEACAM1表達的檢測:Real-timePCR檢測HepG2.2.15和HepG2細胞基因水平CEACAM1的表達。ELISA法檢測培養(yǎng)上清中可溶性CEACAM1的表達水平。
　　 3.肝癌細胞株HepG2.2.15和HepG2細胞上清體外成血管

19、作用檢測:Matrigel膠(80ul/孔)鋪于96孔板底，37℃孵育30分鐘。人臍血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)懸液加到Matrigel膠上(10000個細胞/孔)，根據(jù)HUVECs懸液中加入處理因素的不同分為HepG2細胞上清組、HepG2.2.15細胞上清組、HepG2細胞上清+rhCEACAM1組和HepG2.2.15細胞上清組-CEACAM1組。孵箱中培養(yǎng)6-8小時，顯微鏡下觀察成血管情況。
　　 4.人重組CEACAM

20、1蛋白體外成血管作用檢測:在成血管生成實驗體系中，HUVECs懸液中加入不同濃度的人重組CEACAM1蛋白同時設對照組，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時，顯微鏡下觀察成血管情況。
　　 5.肝癌細胞株HepG2.2.15和HepG2細胞VEGF表達的檢測:Real-timePCR檢測HepG2.2.15和HepG2細胞基因水平VEGF表達。ELISA法檢測培養(yǎng)上清中VEGF表達水平。
　　 6.CEACAM1成管的信號通路檢測:在成血

21、管生成實驗體系中，按照分組分別加入信號通路PI3K抑制劑LY294002和Wortmamin、MEK抑制劑U-0126、JAK3抑制劑ZM39923和NF-kB抑制劑PDTC，作用1小時后加入人重組CEACAM1(50ng/ml)，孵箱中培養(yǎng)6-8小時，顯微鏡下觀察成血管情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.HepG2.2.15細胞株在基因及蛋白水平的CEACAM1表達都明顯高于HepG2細胞株。
　　 2.Hep

22、G2.2.15細胞株上清成管作用明顯強于HepG2細胞株上清。
　　 3.HepG2.2.15細胞株及HepG2細胞株基因和蛋白水平的VEGF表達無明顯差異。
　　 4.人重組CEACAM1對HUVECs細胞有明顯的促進成血管作用，并且具有濃度依賴的特點。
　　 5.PI3K抑制劑對重組CEACAM1成血管作用有明顯抑制作用，而JAK3抑制劑、MEK抑制劑、NF-kB抑制劑則對重組CEACAM1成血管作用無明顯抑