1、Piezo機械敏感離子通道是2010年由Coste[1]等發(fā)現(xiàn)的一類機械敏感離子通道。該詞來源于希臘語(p?′esi)表示壓力的意義,表明其可以被壓力激活的特性。該通道家族包含有Piezo1和Piezo2兩個結構和基因類似的蛋白,他們在包括膀胱、結腸和肺等多種組織中有表達,Piezo2在背根神經(jīng)節(jié)表達豐富。這些蛋白預計包含24-36個的穿膜片段,既往的電壓門控鈉離子和鈣離子通道結構包含六個四折疊的穿膜片段,Piezos顯然代表了一類新型

2、的膜蛋白家族。該研究小組運用RNA干擾技術敲除培養(yǎng)的小鼠背根神經(jīng)細胞的Piezo2可以抑制壓力引發(fā)的快適應機械敏感電流。故而認為該通道家族在壓力的機械感受方面具有重要意義。
　　成牙本質細胞是來源于神經(jīng)嵴的終末分化細胞,其位于牙髓感受最前沿的細胞,雖然他們與牙髓神經(jīng)纖維并無直接的突觸連接[2],但是由于成牙本質細胞突起向牙本質小管內延伸,而眾多的離子通道在成牙本質細胞有表達,故而推測成牙本質細胞是一個具有機械敏感性的細胞[3]。P

3、iezos是否在成牙本質細胞上有表達尚未可知,他在成牙本質細胞感受牙本質小管液的流體運動中扮演何種角色是個值得探討的問題。
　　本研究在成牙本質細胞其他機械敏感離子通道研究的基礎上,采用免疫組化、免疫熒光雙標、熒光金逆追蹤技術觀察Piezo機械敏感離子通道家族在成牙本質細胞的表達和定位,及其與神經(jīng)纖維和纖毛的關系;通過觀察胚胎和干細胞誘導分化過程中通道蛋白的表達情況,推測其在干細胞分化中的作用。采用鈣離子測量系統(tǒng)觀察離子通道在成牙

4、本質細胞感受機械刺激時的生理學作用。本研究首次圍繞Piezo這一新的機械敏感離子通道可能在成牙本質細胞感受、傳導機械刺激中的作用這一核心問題,深入探討牙髓痛覺感受、傳導機制和成牙本質細胞分化作用,為揭示牙本質過敏的關鍵致病機理奠定理論基礎,有可能為牙本質過敏的治療開拓新思路。研究分為以下三部分內容:
　　一、Piezo蛋白的表達定位和追蹤研究
　　本實驗旨在通過PCR、實時定量PCR和免疫熒光標記觀察到Piezo蛋白在成牙本

5、質細胞的表達,同時比較了不同細胞、組織該通道蛋白的表達量,證實在三叉神經(jīng)節(jié)和成牙本質細胞中均有較高表達,在牙周膜組織也有少量表達。免疫熒光的標記證實其主要表達在成牙本質細胞靠近牙本質側,而且可見到由于其主要表達與成牙本質細胞突起而環(huán)繞形成的黑色圓孔,應為成牙本質小管的輪廓。
　　Piezo通道蛋白表達于成牙本質細胞及牙髓內的神經(jīng)細胞和纖維,通過與NF160分子的共染,可以見到其表達區(qū)域大致相當,甚至可見Piezo在成牙本質細胞突起

6、前沿表達,推測其可能比神經(jīng)纖維更為靠前的感受牙本質小管內的液體流刺激。通過磨切大鼠表面牙釉質開放牙本質小管,涂抹熒光金進行逆行追蹤?？梢园l(fā)現(xiàn)經(jīng)過一周,熒光金成功被運輸?shù)饺嫔窠?jīng)節(jié)內而與Piezo共染。
　　由此推斷:成牙本質細胞突起可能是整個牙髓感受外界刺激的最前沿,而且,由于Piezo與神經(jīng)標志物NF160共同表達與成牙本質細胞、牙髓神經(jīng)纖維和三叉神經(jīng)細胞,而開放牙本質小管口的熒光金被成果逆行運輸?shù)饺嫔窠?jīng)節(jié)內,故而推測成牙本質

7、細胞是一個具有某些神經(jīng)細胞特性的感受器細胞,而Piezo作為一個已經(jīng)證明了的機械敏感離子通道可能在其中扮演了感受器的角色。
　　二、Piezo通道蛋白的體內外功能研究
　　通過對體內外成牙本質細胞受到刺激時的通道進行觀察,進一步了解該通道蛋白的功能。實驗包括使用Bioflux模擬小管液流動造成的流體剪切力觀察OLC細胞受力后的電生理學行為的體外實驗和在大鼠牙本質暴露模型對牙本質施加影響,采取不同時間點的大鼠牙髓標本,對其RN

8、A轉錄水平進行觀察,以判斷長時間牙本質暴露帶來的成牙本質細胞長時間受力的可能影響。
　　研究發(fā)現(xiàn):OLC細胞在0.5dyne/cm2的流體剪切力作用下,細胞內鈣離子濃度出現(xiàn)顯著升高,給予GsMTx4[4]這種特異性的Piezo通道阻滯劑后,鈣離子濃度逐步降低。推測:成牙本質細胞是壓力敏感型細胞,0.5dyne/cm2的剪切力可以激活其壓力敏感電流,而Piezo通道特異阻滯劑可以有效的減低鈣離子濃度,懷疑Piezo通道在成牙本質細胞

9、壓力激活的過程中有重要作用。
　　在大鼠牙本質暴露模型,Piezo通道蛋白的表達表現(xiàn)出緩慢增加的趨勢,而且檸檬酸飲水組與單純的牙本質暴露組差異不明顯。推測長期的外界刺激可能造成離子通道的表達增加,這可能是適應性的表達變化。
　　三、Piezo通道蛋白在干細胞分化過程中的功能研究
　　通過PCR法,我們觀察到牙髓干細胞并不表達Piezo通道蛋白,為了進一步了解Piezo通道蛋白在發(fā)育中的時空表達及其意義,我們通過免疫熒光

10、染色對胚胎期和出生后的小鼠各個時期牙胚進行研究,發(fā)現(xiàn)Piezo1和2從E16.5到PD7的牙胚發(fā)育及牙本質形成早期均無明顯表達。初步懷疑:Piezos是在成牙本質細胞的中晚期才開始表達,而再其初期,成牙本質細胞并不具備壓力感受性,故而相關的壓力感受器還沒有表達。
　　進一步的實驗發(fā)現(xiàn):通過對牙髓干細胞礦化誘導和神經(jīng)向誘導,發(fā)現(xiàn)礦化誘導21天后,免疫細胞熒光染色發(fā)現(xiàn) Piezo僅有非特異性的表達,而使用缺氧腦組織勻漿誘導牙髓干細胞向