1、一、PED/PEA-15在前列腺癌中的表達及意義 目的：檢測PED/PEA-15在人前列腺癌組織和細胞(PC-3)中的表達，探討PED/PEA-15在前列腺癌中表達的意義。方法：應用免疫組化SP法檢測前列腺癌和正常前列腺組織中PED/PEA-15的表達；用RT-PCR法檢測PC-3細胞中PED/PEA-15的表達。結果：免疫組化和RT-PCR均顯示PED/PEA-15在前列腺癌中高表達；正常前列腺組織沒有或只有少量很弱的表達。結

2、論：抗凋亡因子PED/PEA-15的表達對前列腺癌的發(fā)展有重要作用。 二、PED/PEA-15真核表達載體的構建及對前列腺癌細胞凋亡的影響 目的：構建PED/PEA-15真核表達載體，探討PED/PEA-15對PC-3細胞凋亡的影響。方法：用RT-PCR法從PC-3中擴增出PED/PEA-15全長基因，以pEGFP-N1為載體構建其真核表達質(zhì)粒。以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PED/PEA-15真核表達載體至前列腺癌細胞(PC-3)中，

3、用流式細胞和MTT法檢測PED/PEA-15對PC-3細胞凋亡和生長的影響。結果：酶切和DNA測序證實PED/PEA-15的真核表達載體構建成功。轉(zhuǎn)染PED/PEA-15真核載體的PC-3細胞凋亡下調(diào)，且對腫瘤殺傷因子KillerTRAIL的敏感性亦下降。結論：抗凋亡因子PED/PEA-15可阻抑前列腺癌細胞(PC-3)的凋亡，PED/PEA-15的表達對前列腺癌的發(fā)展有重要作用。 三、siRNA沉默PED/PEA-15對前列腺

4、癌細胞凋亡的影響 目的：通過構建PED/PEA-15特異的siRNA載體，探討PED/PEA-15對前列腺癌細胞(PC-3)凋亡的影響。方法：利用Invivogen公司的軟件輔助設計PED/PEA-15特異性siRNA序列并體外合成后，克隆入真核表達載體psiRNA-hH1neo。以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染psiRNA-PED/PEA-15至PC-3細胞中，以RT-PCR和Westernblot法檢測psiRNA-PED/PEA-15對PE

5、D/PEA-15表達的影響；用MTT和流式細胞法檢測其對PC-3細胞凋亡的影響。結果：酶切和DNA測序證實合成的siRNA基因序列正確，并已被準確克隆入psiRNA-hH1neo載體。psiRNA-PED/PEA-15可特異性抑制PC-3細胞中PED/PEA-15的表達。轉(zhuǎn)染psiRNA-PED/PEA-15的PC-3細胞凋亡顯著增加(P＜0.05)。結論：PED/PEA-15可阻抑前列腺癌細胞凋亡，PED/PEA-15的表達對前列腺癌

6、的發(fā)展有重要作用。 四、抗凋亡因子XIAP和PED/PEA-15在前列腺癌(PC-3)中的表達及對細胞凋亡的影響 目的：檢測抗凋亡因子XIAP與PED/PEA-15在前列腺癌細胞(PC-3)中的表達，探討二者對前列腺癌細胞凋亡的影響。方法：應用半定量RT-PCR法檢測前列腺癌細胞(PC-3)中PED/PEA-15和XIAP的表達。設計并構建PED/PEA-15和XIAP特異的siRNA載體，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染二者的siRNA

7、載體至前列腺癌細胞(PC-3)中，半定量RT-PCR法檢測特異siRNA載體對PED/PEA-15和XIAP轉(zhuǎn)錄的影響；光鏡觀察細胞形態(tài)改變；流式細胞法檢測細胞凋亡的變化。結果：半定量RT-PCR顯示PED/PEA-15和XIAP均在前列腺癌細胞(PC-3)中高表達。酶切和DNA測序證實XIAP和PED/PEA-15的siRNA載體構建成功。共轉(zhuǎn)染XIAP和PED/PEA-15的siRNA載體入PC-3細胞，可導致XIAP和PED/PE

8、A-15的轉(zhuǎn)錄抑制，并增加PC-3細胞對阿霉素的敏感性凋亡亦明顯增加，處理組凋亡率為79％對照組為46％(p＜0.05)。結論：PED/PEA-15和XIAP在前列腺癌細胞的凋亡中有重要作用。 六、Omi/HtrA2促前列腺癌細胞(PC-3M)凋亡的實驗研究 目的：檢測人前列腺癌細胞(PC-3M)中Omi/HtrA2的表達情況，并構建其小干擾RNA(siRNA)表達載體，探討Omi/HtrA2對PC-3M凋亡的影響。方法

9、：以細胞免疫組化和RT-PCR法檢測Omi/HtrA2在前列腺癌細胞系(PC-3M)和正常前列腺細胞中的表達。利用Invivogen公司的軟件輔助設計Omi/HtrA2特異性siRNA序列，體外合成后將其克隆入真核表達載體psiRNA-hH1neo。以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染psiRNA-Omi/HtrA2載體至PC-3M中，以RT-PCR和Westernblot法檢測psiRNA-Omi/HtrA2對Omi/HtrA2轉(zhuǎn)錄和表達的沉默效應。用MT

10、T和流式細胞法檢測siRNA導致Omi/HtrA2基因沉默后，PC-3M細胞凋亡的變化。結果：細胞免疫組化和RT-PCR均顯示Omi/HtrA2在PC-3M細胞中高表達。酶切和DNA測序證實合成的siRNA基因序列正確，并已被準確克隆入psiRNA-hH1neo載體中。psiRNA-Omi/HtrA2載體可特異性抑制PC-3M細胞中Omi/HtrA2的表達。轉(zhuǎn)染psiRNA-Omi/HtrA2載體的PC-3M細胞凋亡下調(diào)。結論：促凋亡因

11、子Omi/HtrA2可導致前列腺癌細胞凋亡，Omi/HtrA2的表達對前列腺癌的發(fā)展有重要作用。 七、Omi/HtrA2抑制PED/PEA-15促前列腺癌細胞(PC-3)凋亡的研究背景與目的：促、抑凋亡因子間的相互作用與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，Omi/HtrA2是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡調(diào)節(jié)因子，PED/PEA-15是一種廣泛表達的抗凋亡蛋白，本研究旨在探討Omi/HtrA2對PED/PEA-15表達和前列腺癌細胞(PC-3)凋亡的

12、影響。方法：構建Omi/HtrA2的表達載體和siRNA載體，并用脂質(zhì)體法將二載體分別轉(zhuǎn)染至PC-3細胞中，Westernblot和ELISA法檢測Omi/HtrA2對PED/PEA-15表達和細胞凋亡的影響；caspase-8檢測試劑盒檢測PED/PEA-15對caspase-8活性的影響；Westernblot、RT-PCR檢測Omi/HtrA2特異siRNA序列對其轉(zhuǎn)錄、翻譯的影響，流式細胞法檢測siRNA導致Omi/HtrA2基

13、因沉默后，PC-3細胞凋亡的變化。結果：酶切和DNA測序證實Omi/HtrA2的表達載體和siRNA載體構建成功。通過轉(zhuǎn)染Omi/HtrA2表達載體高表達Omi/HtrA2可抑制PED/PEA-15表達，并增加腫瘤細胞的凋亡率；抑制PED/PEA-15的表達可提高caspase-8活性。siRNA導致Omi/HtrA2基因沉默后PC-3細胞對順鉑的敏感性降低。結論：Omi/HtrA2可通過抑制抗凋亡蛋白PED/PEA-15表達而在PC細

14、胞凋亡中發(fā)揮重要作用。 八、高表達Omi/HtrA2對PED/PEA-15表達缺陷的前列腺癌細胞凋亡的影響 目的探討Omi/HtrA2促前列腺癌細胞凋亡機制，找尋前列腺癌治療新方法。方法分別構建促凋亡因子Omi/HtrA2的真核表達載體、抗凋亡蛋白PED/PEA-15的特異siRNA載體。用脂質(zhì)體法將PED/PEA-15的siRNA載體轉(zhuǎn)染入前列腺癌細胞(PC-3)中，經(jīng)G418篩選獲得抗性亞克隆細胞株，RT-PCR、W

15、esternblot法對亞克隆細胞株進行PED/PEA-15基因鑒定。將Omi/HtrA2表達載體轉(zhuǎn)染入亞克隆細胞株，流式細胞儀檢測高表達Omi/HtrA2對亞克隆細胞株凋亡的影響。結果酶切和DNA測序證實Omi/HtrA2表達載體和PED/PEA-15特異siRNA載體構建成功。G418篩選出的亞克隆細胞株中PED/PEA-15的表達極弱。在亞克隆細胞株中高表達Omi/HtrA2細胞凋亡率較高、XIAP的抑制亦更明顯。結論抗凋亡蛋白P