1、目的：
　　 觀察人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)是否有人剪切修復基因XPD(xeroderma pigmentosum D，XPD)的表達；探討人剪切修復基因XPD對人臍靜脈內皮細胞的促凋亡作用。
　　 方法：
　　 1、培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞，48-72小時后提取細胞mRNA，通過RT-PCR檢測XPD在人臍靜脈內皮細胞的表達情況。

2、>　　 2、重組質粒pEGFP-N2/XPD轉染臍靜脈內皮細胞。搖菌提取質粒，重組質粒pEGFP-N2/XPD和空載質粒pEGFP-N2。將上述兩種質粒用脂質體分別通過瞬時轉染的方法轉染人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，用正常的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)作為空白對照，與轉染了重組質粒pEGFP-N2/XPD和空載質粒pEGFP-N2的人臍靜脈內皮細胞具有相同代數和遺傳背景。常規(guī)培養(yǎng)48小時，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白報告基因的表

3、達情況，通過RT-PCR及Westernblot檢測XPD基因表達情況進一步證實轉染是否成功。
　　 3、XPD基因對臍靜脈內皮細胞的凋亡作用，實驗分為3組：①空白對照組；②空載質粒pEGFP-N2組；③重組質粒pEGFP-N2/XPD組，應用以下方法：
　　 (1)在96孔板中各組細胞轉染，常規(guī)培養(yǎng)48小時后，通過MTT法觀察各組細胞的增殖活力。
　　 (2)各組細胞轉染后，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況；<

4、br>　　 (3)提取各組細胞mRNA，通過RT-PCR檢測各組細胞的XPD、Bc1-2、Bax和wt-p53表達量的變化。
　　 (4)提取各組細胞總蛋白，通過Western blot檢測各組細胞的XPD、Bc1-2、Bax和wt-p53蛋白表達量的變化。
　　 結果：
　　 1、臍靜脈內皮細胞有XPD表達。
　　 2、在熒光顯微鏡下，可在轉染了重組質粒pEGFP-N2/XPD或空載質粒pEGFP-N

5、2的細胞中觀察到綠色熒光，RT-PCR和Western blot結果示：重組質粒pEGFP-N2/XPD的轉染組XPD的mRNA及蛋白表達與空白對照組及空載質粒pEGFP-N2組相比明顯增高(數值分別為1.104±0.098VS0.273±0.029或0.295±0.031，0.861±0.068 VS0.351±0.029或0.373±0.031，P<0.05)；空白對照組和空載質粒pEGFP-N2組之間差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05

6、)，表明轉染成功。
　　 3、MTT結果顯示，重組質粒pEGFP-N2/XPD的轉染組細胞存活率，與空白對照組及空載質粒pEGFP-N2組相比明顯抑制了HUVEC增殖活力(52.35％VS100％或95.89％，P<0.05)，空白對照組和空載質粒pEGFP-N2組之間差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 4、流式細胞儀結果顯示，重組質粒pEGFP-N2/XPD的轉染組細胞凋亡率，與空白對照組及空載質粒pEGFP-N

7、2組相比細胞凋亡明顯增加(16.43±3.57％VS2.41±1.01％或3.76％±1.27，P<0.01)，空白對照組和空載質粒pEGFP-N2組之間差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 5、重組質粒pEGFP-N2/XPD的轉染組與空白對照組及空載質粒pEGFP-N2組相比Bc1-2的mRNA的表達明顯降低、Bax和wt-p53表達增高(數值分別為：0.017±0.004VS0.140±0.016或0.121±0.01

8、4，0.911±0.126VS0.492±0.051或0.520±0.055，0.993±0.122VS0.352±0.037或0.371±0.041，P<0.05或P<0.01)；其蛋白的表達亦有相應的結果，空白對照組和空載質粒pEGFP-N2組之間差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結論：
　　 (1)首次觀察臍靜脈內皮細胞表達XPD基因；
　　 (2)上調XPD表達，促進HUVEC的凋亡；