1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis，PBC)是一種病因未明的慢性進行性膽汁淤積性肝臟疾病。其病理改變主要以肝內細小膽管的慢性非化膿性破壞、匯管區(qū)炎癥、慢性膽汁淤積、肝纖維化為特征，最終發(fā)展為肝硬化和肝衰竭。多見于中年女性，男女比例約為1:9。PBC是一種典型的自身免疫性疾病，其細胞免疫及體液免疫均發(fā)生異常反應?？乖禺愋訲細胞與自身抗原、病原體之間發(fā)生了交叉反應使T細胞打破自身免疫耐受，激活的CD4及CD

2、8T淋巴細胞持續(xù)傷害膽小管，肝細胞和膽管上皮細胞，使其對激活的T淋巴細胞敏感性增強，加重了免疫介導的細胞損傷。PBC患者主要的診斷指標是抗線粒體抗體陽性。PBC患者目前無特效治療，主要就是針對癥狀的支持治療，熊去氧膽酸是PBC的主要治療藥物。但該藥只對部分患者有效，且只能延遲疾病進展。最終患者仍需選擇肝移植治療，但目前肝移植在我國開展仍不廣泛，許多患者都得不到有效治療，因此開發(fā)新的治療方案顯得尤為重要。
　　 固有免疫系統(tǒng)是抵抗

3、病原體感染的第一道防線，單核細胞則是固有免疫系統(tǒng)的重要力量，其表面存在可識別微生物相關分子模式(PAMP)的受體(PRR)。Toll樣受體就是PRR的一種類型。膽管內皮細胞就是通過PRR來識別PAMP。有文獻報道，固有免疫異常是PBC的重要發(fā)病特征，而PBC患者單核細胞功能亢進也是眾所周知的。說明固有免疫可能參與PBC的發(fā)病，但具體機制仍需深入研究。
　　 microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類在轉錄后水平對目的基因的

4、表達進行調控的非編碼RNA。與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)(UTR)結合后，miRNA可以直接抑制其翻譯或者將其降解。研究表明，在機體的發(fā)育、腫瘤的產生、細胞的凋亡等眾多生理或者病理過程中，microRNA都發(fā)揮著極為重要的調控作用。近年來，microRNA的免疫調控功能日漸引起了國內外學者的關注，基礎免疫學的研究發(fā)現(xiàn)：microRNA是調控免疫細胞的發(fā)育、分化以及免疫應答過程的重要因子；臨床免疫學研究也發(fā)現(xiàn)，多種自身免疫性疾病的發(fā)病

5、機制與microRNA密切相關。
　　 基于以上情況，本課題擬通過測定PBC患者外周血T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞中miR-302e表達情況，測定其生物學功能，并找到miR-302e靶基因，初步了解miR-302e在PBC固有免疫中的作用，從而為PBC的免疫學治療提供新的靶點。
　　 第一部分，PBC患者各細胞亞群內miR-302e的相對表達水平
　　 最近的研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者肝臟內有多個microRNh表

6、達異常，提示microRNA參與了PBC的發(fā)病機制。本部分根據(jù)前期miRNA芯片表達譜篩選結果，選擇了降幅比較明顯的miR-302e，我們使用熒光定量PCR方法檢測PBC患者及健康對照者PBMC中miR-302e表達量，使用磁珠分選，流式細胞術等方法分選了PBMC中T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞，使用熒光定量PCR方法檢測三系細胞中miR-302e及miR-302a表達量。結果發(fā)現(xiàn)PBC患者PBMC中miR-302e的表達約為健康個體

7、的30％，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。PBC患者B細胞、T細胞和單核細胞內miR-302e的表達均較健康個體顯著降低，其中尤以單核細胞內miR-302e的差異最為顯著(P值均小于0.001)。作為對照，我們還同時檢測了上述細胞亞群中miR-302a的表達差異，結果發(fā)現(xiàn)：PBC患者B細胞、T細胞和單核細胞內miR-302a的表達與健康對照個體之間的差異并不顯著(P值均大于0.05)。
　　 本部分研究說明PBC患者PBM

8、C中miR-302e表達量較健康對照明顯降低，并在單核細胞中表達最為明顯。說明單核細胞內miR-302e表達下調在是PBC發(fā)病的重要特征。
　　 第二部分，miR-302e負向調節(jié)LPS誘導THP-1細胞釋放炎癥因子的能力
　　 在本部分研究中，我們通過改變特定免疫細胞內miRNA-302e的表達來分析其對細胞功能的調節(jié)作用。我們選用THP-1細胞，將miR-302emimics、inhibitor、control轉染入

9、THP-1細胞，以LPS刺激，使用熒光定量PCR，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等發(fā)放檢測IL-6及TNF-α的表達。我們發(fā)現(xiàn)，胞內miR-302e的豐度發(fā)生了顯著的變化(P值均小于0.01)。以100ng/mlL2S刺激THP-1細胞可以顯著誘導IL-6和TNF-α的產生，而miR-302emimics和miR-302einhibitor則分別可以顯著抑制和促進炎癥因子IL-6和TNF-α的產生(P值均小于0.01)。
　　

10、本部分研究說明miR-302e可以負向調節(jié)THP-1細胞經(jīng)LPS刺激后釋放炎癥因子的能力。提示miR-302e可以負向調節(jié)固有免疫應答的因素，可能是PBC發(fā)病機制中的重要因子，具有潛在的治療價值。
　　 第三部分，PBC患者單核細胞對LPS刺激呈現(xiàn)高反應性
　　 本部分我們使用LPS刺激PBC患者及健康對照者單核細胞，以熒光定量PCR及ELISA技術來檢測炎癥因子表達的改變。結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激后，PBC患者單核細胞IL

11、-6及TNF-α水平明顯高于經(jīng)LPS刺激的健康對照組單核細胞(P值均小于0.001)。
　　 這些結果表明PBC患者的單核細胞對LPS刺激呈現(xiàn)出高反應性。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PBC患者單核細胞miR-302e表達下調，且這種表達下調可能是導致PBC患者單核細胞表現(xiàn)出明顯“促炎”特性的原因之一。因此，miR-302e可能是PBC潛在的治療靶點。
　　 第四部分，IRAK4是miR-302e的靶點
　　 前面的研究表

12、明PBC可誘導miR-302e表達降低以及TNF-α和IL-6表達升高。并且miR-302e可負向調節(jié)LPS誘導THP-1細胞釋放炎癥因子的能力。為進一步研究miR-302e調控TNF-α和IL-6表達機制是否是通過TLR4途徑完成的，在本部分的研究中，我們采用了TargetScan軟件預測了miR-302e的靶基因，發(fā)現(xiàn)TLR4信號通路中重要因子IRAK-4是miR-302e的靶基因，隨后，我們采用報告基因，熒光定量PCR，weste

13、rn等技術，進行了驗證。
　　 檢測結果說明：IRAK4是miR-302e的靶基因，miR-302e可負向調節(jié)IRAK4的表達量，miR-302e通過IRAK4調節(jié)TLR4信號通路可能是造成PBC患者單核細胞功能異常的原因。
　　 第五部分，siRNA沉默單核細胞IRAK4的表達可減弱LPS刺激導致的炎癥因子的表達
　　 在前面的實驗中我們發(fā)現(xiàn)miR-302e可以負向調節(jié)炎癥反應，而且發(fā)現(xiàn)miR-302e的調節(jié)作

14、用正是PBC單核細胞功能亢進的原因，在第四部分中，我們證明了IRAK4是miR-302e的靶基因，但是miR-302e調節(jié)單核細胞對LPS反應性是否是通過IRAK4起作用目前尚不明確。在本部分研究中，我們采用siRNA技術沉默THP-1細胞上的IRAK4，通過熒光定量PCR及ELISA等方法檢測沉默IRAK4后，炎癥因子的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)在轉染IRAK4siRNA后，加LPS刺激THP-1細胞，于12小時后檢測細胞內炎癥因子的表達量，