1、本課題利用與結核分枝桿菌有相同細胞壁結構，但生長快速且無致病性的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis，Sm)mc<'2>155菌株作為實驗模型，以glmU基因作為研究對象，并采用基于同源重組的插入突變方法使．glmU基因發(fā)生突變。目的是用基因敲除的方法證明結核分枝桿菌中glmU基因是分枝桿菌生長過程中所必需的基因，并對glmU基因敲除菌株進行了一系列的表型變化觀察及細胞壁結構的聚糖組成成分分析，從而證明glmU基

2、因在分枝桿菌生長過程中具有重要作用，這將為其作為研發(fā)抗結核新藥的靶標提供有力的證據(jù)。 本論文獲得以下結果： 1.SmglmU基因的擴增和克隆從TIGR基因數(shù)據(jù)庫(http://www.tigr.org/tdb/)獲得M smegmatis me<'2>155菌株的glmU基因的核苷酸序列。根據(jù)Sm glmU基因的核苷酸序列設計引物，用高保真LA Taq DNA聚合酶從mc<'2>155基因組中擴增Sm glmU基因及其上

3、游約500 bp的DNA序列，并將其克隆到pMD18-T的克隆質(zhì)粒上，用BcaBEST測序引物和M13引物對Sm glmU基因的兩端進行DNA序列測定，將測序結果與已知的SmglmU 基因進行相似性比較，得到與mc<'2>155基因組上Sm glmU基因序列完全一致的克隆質(zhì)粒。 2.條件性復制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>的構建將來自于質(zhì)粒pUC4K的Kan<'R>月克隆到Sm glmU基因內(nèi)部，產(chǎn)生

4、SmglmU::Kan<'R>突變基因。將Sm glmU::Kan<'R>月突變基因克隆到pPR27-xylE質(zhì)粒，構建出條件性復制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>。pPR27攜帶溫度敏感型復制子，該質(zhì)粒在30°C條件下可以復制，在42°C條件下不能復制。pPR27攜帶的sacB基因為負選擇標記，該基因表達產(chǎn)物蔗糖6-果糖基轉移酶(Levansucrase)能夠分解蔗糖，產(chǎn)生對細菌生長有害的聚果糖，使細菌死亡。

5、xy/E基因產(chǎn)物是兒茶酚2，3-氧化還原酶，它能氧化兒茶酚成黃色的化合物，使菌落呈現(xiàn)金黃色。 3.營救質(zhì)粒的構建營救質(zhì)粒攜帶正常的M tuberculosis glmU基因，其作用是在mc<'2>155 glmU基因敲除菌株中補償突變的glmU基因的功能。本實驗用高保真LA Taq DNA聚合酶分別從M tuberculosis H37Rv菌株基因組中擴增Tb glmU基因，構建營救質(zhì)粒pCG76-Phsp60-Tb glmU。

6、pCG76為分枝桿菌表達質(zhì)粒，pCG76攜帶溫度敏感型復制子，即該質(zhì)粒在30°c條件下可以復制，在42°c條件下不能復制。TbglmU基因的表達受來源于分枝桿菌BCG熱休克蛋白60的啟動子Phsp60控制。pCG76-phsp60-Tb glmU營救質(zhì)粒用于證明TbglmU是否為分枝桿菌生長相關基因。 4.第一次同源重組突變菌株mc<'2>155 glmU SCO-1的篩選將條件復制性質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::

7、Kan<'R>電轉化到mc<'2>155感受態(tài)細胞中。依據(jù)pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>質(zhì)粒在30°C時能復制，在42°C時不能復制，在42°C條件下培養(yǎng)攜帶pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>質(zhì)粒的mc<'2>155，迫使pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>質(zhì)粒的Sm glmU::Kan<'R>與mc<'2>155基因組中的SmglmU發(fā)生同源重組，使Sm glmU::Kan

8、<'R>以及sacB基因、xylE基因整合到mc<'2>155基因組中。用地高辛標記的Sm glmU探針(DIG-Sm glmU)對經(jīng)過Sinai酶切的第一次重組菌落的基因組DNA進行Southern雜交分析，當結果中出現(xiàn)預期的雜交條帶為發(fā)生第一次同源重組的突變菌株mc<'2>155 glmU SCO-1(the firstsingle crossover)。 5．第二次同源重組突變菌株mc<'2>155 glmU SCO-2(glmU

9、基因敲除)的篩選將攜帶 Tb glmU 基因的營救質(zhì)粒轉化到mc<'2>155 glmU SCO-1 感受態(tài)細胞中，在30℃條件下，在含10﹪蔗糖的選擇性LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)轉化的mc<'2>155glmU SCO-1，由于pPR27-xylE-Sm glmU∶∶Kan<'R>的 sacB基因和 xylE 基因也被整合到mc<'2>155 glmU SCO-1 基因組中，sacB基因的表達產(chǎn)物蔗糖6-果糖基轉移酶能水解蔗糖，產(chǎn)生引起mc<

10、'2>155 glmU SCO-1 致死的聚果糖，在這種選擇壓力下，mc<'2>155 glmU SCO-1 基因組中的Sm glmU∶∶Kan<'R>與Sm glmU發(fā)生第二次同源重組，將Sm glmU基因、scaB基因以及．xylE基因從mc<'2>155 glmU SCO-1 基因組中刪除并被核酸酶水解，基因組中只存在Sm glmU∶∶Kan<'R>。營救質(zhì)?？梢栽趍c<'2>155glmU KOT 突變菌株中表達出 Tb Glm

11、U蛋白質(zhì)，從而補償基因組上失活的SmGlmU的生物學作用。同樣地，應用Southem印跡方法篩選出mc<'2>155 glmUSCO-2(the second single crossover)，即 Sm glmU 基因敲除菌株 mc<'2>155 glmU KOT(glmUknock out，基因敲除)6．生長曲線的測定在30℃及42℃條件下，每間隔24小時測定mc<'2>155 glmU KOT 突變菌株在600 nm處的光吸收值，

12、并繪制生長曲線。生長曲線的結果表明，對照的野生型菌株即能在30℃條件下又能在42℃條件下生長；而突變菌株在30℃條件下能夠生長，而在42℃條件下卻失去生長能力。因而說明了結核分枝桿菌的glmU基因為分枝桿菌生長相關基因。 7．溫度轉換后生長曲線和菌落形成單位(CFU)曲線的繪制mc<'2>155 glmU KOT菌株和野生型的mc<'2>155菌株在30℃條件下生長至OD<,600>為0.09，然后轉變溫度為42℃后繼續(xù)生長，每

13、隔24小時測定其在600 nm的吸光度值，并繪制生長曲線。溫度轉換后的生長曲線結果顯示，野生型的mc<'2>155菌株，溫度的轉換對其生長沒有明顯的影響；而mc<'2>155 glmU KOT、菌株，在轉變溫度后的24小時之內(nèi)，細菌會繼續(xù)生長，并達到吸光度值的最高值；然而繼續(xù)延長時間，細菌不再生長，其吸光度值持續(xù)下降。對mc<'2>155 glmU KOT 菌株同時進行對可活菌落進行計數(shù)的菌落形成單位(colony forming un

14、it，CFU)測定，結果表明mc<'2>155 glmU KOT 菌株的吸光度值與CFU具有相同的趨勢，即都在轉變溫度后的24小時左右達到最高值，接下來持續(xù)下降。此結果進一步證實glmU基因為分枝菌酸生長所必需的基因，且mc<'2>155 glmU KOT 菌株在溫度轉變后光吸收值的降低是由于細菌的死亡。 8．應用顯微鏡技術對細胞形態(tài)的觀察mc<'2>155 glmU KOT菌株的生長條件與CFU測定實驗中細菌的生長條件相同，收

15、獲細菌后，應用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)。光鏡的結果顯示，當細胞生長在30°C時細胞呈野生型細菌般的長棒狀；但當細胞的生長溫度轉變?yōu)?2°C后，雖然初始時細胞依然能維持棒狀，但細胞長度卻變的比野生型的細胞短很多；隨著在42°C生長時間的增加，細胞逐漸開始變?yōu)榍蛐危⑶視r間越長球形細胞所占的比例越大。 9.應用氣相色譜對細胞壁糖組分的分析及應用高效液相Dionex陰離子交換層析對阿拉伯糖組分分析mc<'2>155 glm

16、U KOT菌株生長在30°C至其吸光度值為0　09后，轉移到42°C生長3天，提取細菌細胞壁的核心組分-分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖(mycolic acid，arabinogalactan，peptidoglycan，mAGP)，然后應用氣相色譜(GasChromatography，GC)分析mAGP中糖的組成成分。本實驗中以mc<'2>155 glmUKOT菌株生長在30°C的細菌作為對照。GC結果表明，在活性GlmU缺失的mc

17、<'2>155 glmU KOT菌株的mAGP中，阿拉伯糖含量明顯增加，半乳糖含量略有增加但不明顯;對照菌株與mc<'2>155野生型菌株相比沒有顯著不同。 用堿裂解法移除mAGP中的分枝菌酸和肽聚糖，使之成為可溶性的聚阿拉伯半乳糖(arabinogalactan，AG)。采用來自纖維單胞菌(Cellumonas gelida)的阿拉伯糖內(nèi)切酶消化可溶性AG，并應用Dionex陰離子交換層析柱分析被內(nèi)切酶消化的樣品，結果表明，m