1、細胞凋亡是指細胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而主動有序的死亡，細胞凋亡不僅是免疫反應的重要部分，也與許多疾病尤其是癌癥的發(fā)生有著密切的關系。對蝦是一類低等的無脊椎動物，其免疫系統(tǒng)反應只有先天性免疫系統(tǒng)，細胞凋亡屬于對蝦先天性免疫系統(tǒng)的血細胞防御系統(tǒng)，其在對蝦對抗外界不良環(huán)境過程中起著十分重要的作用，已有研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在對蝦抗病毒過程中起到了十分重要的作用。研究對蝦細胞凋亡的調(diào)控機理，能夠為動物抗病毒免疫及癌癥的發(fā)生發(fā)展提供新的思路和方法。很多研究

2、報道發(fā)現(xiàn)，非編碼小RNA---miRNA能夠通過調(diào)節(jié)參與細胞凋亡的基因的轉錄后水平，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡，但是目前對參與調(diào)節(jié)細胞凋亡的miRNA的研究不多，因而進行這一方面的研究具有十分重要的意義。
　　 本實驗室的前期研究中，通過對對蝦體內(nèi)miRNAs進行測序，獲得了參與調(diào)控對蝦細胞凋亡的miRNA。本試驗中，通過將三種不同處理的對蝦血淋巴細胞（正常血淋巴細胞，誘導細胞凋亡的血淋巴細胞，抑制細胞凋亡的血淋巴細胞）進行對蝦miRNA

3、芯片雜交試驗，篩選獲得10條與對蝦細胞凋亡相關的miRNA。通過northernblot，結果顯示有6條miRNA的northernblot結果與芯片數(shù)據(jù)相符。挑取其中一條進化保守的miR-100，進一步的研究其在對蝦細胞凋亡過程中的作用。通過將特異修飾的miR-100反義核酸注射到對蝦體內(nèi)敲低miR-100的表達，檢測對蝦血淋巴細胞caspase3/7酶活，試驗結果顯示細胞內(nèi)的caspase3/7酶活活力明顯上升，說明miR-100能

4、夠抑制對蝦細胞細胞凋亡的發(fā)生。為了進一步研究miR-100在對蝦抗病毒過程中的作用，在通過注射miR-100的反義核酸降低對蝦體內(nèi)的miR-100含量的情況下，檢測對蝦感染病毒的拷貝數(shù)和對蝦死亡率的變化，結果顯示表明注射miR-100反義核酸引起的細胞凋亡能夠降低病毒的拷貝數(shù)和對蝦的死亡率，從而起抗病毒作用。
　　 目前，越來越多的研究報道顯示，細胞miRNA的異常表達與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關系。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-100

5、是從無脊椎動物到脊椎動物進化保守的一種miRNA，在乳腺癌細胞系SK-BR-3中miR-100相比于其他乳腺細胞（MCF-7和MDA-MB-453）其含量明顯的上調(diào)。因而，推測miR-100在乳腺癌細胞中也具有抑制細胞凋亡的作用。為了研究miR-100在乳腺癌細胞凋亡過程中的作用，我們通過轉染miR-100的反義核酸或者miR-100前體分別敲低或者過量表達miR-100。在此基礎上，通過檢測細胞caspase3/7酶活、細胞線粒體活力

6、、凋亡關鍵蛋白的含量、AnnexinⅤ流式檢測細胞凋亡等方法，判斷乳腺癌細胞的細胞凋亡是否受到影響。試驗結果顯示，轉染miR-100反義核酸的乳腺癌細胞會發(fā)生明顯的細胞凋亡，而轉染miR-100前體的乳腺癌細胞則沒有細胞凋亡的發(fā)生，這說明miR-100能抑制乳腺癌細胞SK-BR-3細胞凋亡的發(fā)生。
　　 為了進一步的探索miR-100調(diào)節(jié)乳腺癌細胞細胞凋亡的分子機理，我們通過表達譜芯片和生物信息學的方法篩選miR-100可能的靶

7、基因，結果發(fā)現(xiàn)FGFR3和MTMR3基因可能是miR-100的靶基因;根據(jù)雙熒光報告質粒靶基因驗證系統(tǒng)的研究結果，發(fā)現(xiàn)MTMR3是miR-100直接作用的靶基因。MTMR3在miR-100含量被敲低的乳腺癌細胞內(nèi)過量表達，能促進p27蛋白的表達，抑制細胞周期阻滯在G2/M期。但是，通過RNAi方法抑制MTMR3在乳腺癌細胞里的mRNA水平后，再轉染miR-100反義核酸仍然能夠引起細胞發(fā)生凋亡，說明miR-100能調(diào)控多個參與細胞凋亡的