1、第一部分亮氨酸重復蛋白LRRC33對TLR信號通路的調(diào)控
　　Toll樣受體是機體防御病原微生物（病毒、細胞內(nèi)的細菌或寄生蟲）的先天性免疫反應中的重要識別者[1]。盡管先天性免疫系統(tǒng)可以抵抗感染性病原體的侵襲，但是TLR信號通路的過度激活會導致過度炎癥反應等嚴重后果。因此，抑制過度免疫反應與維持先天性免疫穩(wěn)態(tài)是當今的研究熱點。
　　本部分以LRRC33作為研究對象，通過各種實驗手段，闡述了其在抑制TLR信號通路活性過程中的重

2、要作用。利用RT-PCR技術和原位雜交技術，對LRRC33的組織分布進行了檢測，發(fā)現(xiàn)LRRC33廣泛表達在機體的免疫器官中。利用NF-κB報告系統(tǒng)、免疫共沉淀和酶聯(lián)免疫吸附技術，分析了LRRC33是否調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性以及其與TLRs之間的相互作用情況，并進一步通過免疫熒光染色技術，檢測了LRRC33對NF-κB亞單位p65的核轉(zhuǎn)移情況的影響，探討了LRRC33在TLR信號通路中的作用及其分子機制。構建了LRRC33的缺失片段

3、（分別為LRRC33的胞外區(qū)、LRRC33的胞內(nèi)區(qū)），分析了LRRC33的功能。最后，利用從人外周血中分離出的樹突細胞，分析了沉默LRRC33對人樹突細胞功能的影響。
　　主要結果:
　　1.通過利用分析跨膜區(qū)和基序預測的軟件SMART和Pfarm，本研究鑒定出一種新的TLR同源物-LRRC33，LRRC33蛋白的細胞外區(qū)域包含17個潛在的亮氨酸重復基序，但是LRRC33蛋白的胞內(nèi)區(qū)缺失了Toll/IL-1受體（TIR）區(qū)域

4、;RT-PCR和免疫組化結果顯示LRRC33廣泛表達在機體的免疫器官中，尤其是在骨髓、胸腺、肝臟、肺、腸、腎臟和心臟中高表達;同時，本研究也分析了不同細胞系中LRRC33的表達情況，RT-PCR結果顯示LRRC33高表達于U937細胞和從人外周血分離出的單核細胞中，但是在從單核細胞向成熟樹突細胞分化的過程中，LRRC33的表達量逐漸降低。這表明LRRC33在細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用。
　　2.免疫共沉淀結果顯示，LRRC33可

5、以與TLR2/TLR3/TLR4/TLR9都發(fā)生相互作用。相反地，LRRC33不與MyD88發(fā)生相互作用。例如，在HEK293T細胞中，過表達LRRC33可以抑制TLR2/TLR4介導的基底水平上的NF-κB的激活;當加入PGN/LPS刺激后，LRRC33可以顯著性抑制NF-κB的活性，并且大大降低了IL-8的釋放。同時結果發(fā)現(xiàn)LRRC33可以阻礙p65的核轉(zhuǎn)移過程。
　　3.通過構建LRRC33的缺失突變體，本研究鑒定出LRRC

6、33負責與TLRs發(fā)生相互作用的具體區(qū)域。結果顯示，LRRC33的胞外區(qū)而非胞內(nèi)區(qū)可以與TLR2發(fā)生相互作，并且抑制NF-κB的活性和IL-8的釋放。LRRC33也可以通過抑制AP-1的活性從而阻礙JNK的激活。為進一步驗證LRRC33胞外區(qū)的哪段LRRs介導了與TLRs的相互作用，本研究構建了D1（缺失1-9 LRRs），D2（缺失10-14 LRRs），D3（缺失15 LRRs）和D4（缺失16-17 LRRs）。結果發(fā)現(xiàn)D1-D4

7、都可以與TLR2相互結合，并且抑制NF-κB的活性和IL-8的分泌。
　　4.沉默樹突細胞中內(nèi)源性表達的LRRC33會導致NF-κB的激活，并且可以顯著性提高LPS刺激下TNF-α的釋放，同時蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結果也顯示沉默LRRC33的表達可以誘導LPS介導的JNK和p38的激活。
　　主要結論:
　　LRRC33在維持機體先天性免疫平衡的過程中發(fā)揮廣泛而且重要的作用。LRRC33能夠與多個TLR相互作用，抑制TLR

8、介導的NF-κB的激活，同時也可以抑制AP-1的激活，并降低多個細胞因子的產(chǎn)生，這表明了LRRC33是一個重要的炎癥反應調(diào)節(jié)者?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)了一種可以負調(diào)控TLR信號通路的包含LRR序列的蛋白-LRRC33。這一發(fā)現(xiàn)對闡釋TLR信號通路和炎癥反應在人類發(fā)育和疾病中的功能產(chǎn)生了深遠的意義，同時也將為治療人類過度免疫反應提供理論基礎。
　　第二部分泛素連接酶復合體介導Smoothened泛素化的研究
　　Hedgehog(H

9、h)蛋白作為一種形態(tài)發(fā)生素在形態(tài)形成和細胞生長中發(fā)揮重要作用[26]。Hh信號通路也與組織修復和干細胞維持相關。Hh信號通路的異常會導致先天性缺陷和癌癥的發(fā)生[27，35]。從果蠅到哺乳動物中，Hh信號通路的傳導方式是保守的。其中Patched(Ptc)是信號受體;而七跨膜蛋白Smoothened(Smo)是信號傳導器，它也是Hh信號通路中的一個關鍵組分。在過去十幾年中，科學家已經(jīng)對Smo進行了廣泛的研究，但是Smo的作用機理仍然存在很

10、多疑團。研究表明Hh和磷酸化可以正調(diào)節(jié)Smo，而去泛素化和泛素化負向調(diào)節(jié)Smo[68]。最近的研究表明沉默E1泛素激活酶Uba1也可以上調(diào)Smo的蛋白水平。泛素化是蛋白質(zhì)修飾的一種方式，它可以導致蛋白質(zhì)降解、內(nèi)吞、相互作用和運輸[28，33]。本研究旨在探討Smo泛素化的調(diào)節(jié)機制。
　　本研究通過各種實驗手段探討了E3泛素連接酶是否參與Smo的調(diào)節(jié)過程，E3泛素連接酶怎樣調(diào)節(jié)Smo的泛素化水平從而抑制其細胞表面聚集。利用RNAi篩

11、選方法尋找Smo的E3泛素連接酶。利用RNAi干擾技術靶向了一系列待定基因;利用基因修飾篩選的方法觀察了果蠅的表型特征;直接檢測了S2細胞中Smo的泛素化水平。通過沉默內(nèi)源性或過表達E2泛素結合酶Eff/E3泛素連接酶CG9153進一步證實了其對Smo泛素化水平的影響。通過免疫共沉淀技術檢測CG9153是否通過與Smo相互作用從而調(diào)節(jié)Smo的活性。通過構建CG9153的缺失片段（包括N1、N2、HECT），檢測其與Smo結合的特定位點。

12、通過用溶酶體途徑抑制劑NH4Cl和蛋白酶體途徑抑制劑MG132處理S2細胞，檢測CG9153調(diào)節(jié)Smo的特異性。通過體內(nèi)泛素化實驗檢測了Cullins是否參與調(diào)節(jié)了Smo的泛素化水平。最后，通過顯微注射技術，檢測了過表達或者沉默Uba1/Eff/CG9153/Cul4對果蠅翅盤中Smo聚集程度/蛋白水平的影響。
　　主要結果:
　　1.HECT家族的CG9153和Eff分別是Smo的泛素連接酶和泛素結合酶。沉默CG9153或

13、者Eff可以下調(diào)Smo的泛素化水平，相反地，過表達CG9153可以上調(diào)Smo的泛素化水平，但是過表達Eff則不可以。這表明Eff需要CG9153才可以將泛素分子傳遞給底物。此外，CG9153可以與Smo相互結合，而且Hh阻礙他們之間的相互作用從而降低Smo的泛素化水平。同時，Hh可以上調(diào)CG9153的泛素化水平，揭示了阻隔泛素連接酶與其底物的相互作用促使泛素分子在連接酶上累積。
　　2.CG9153調(diào)節(jié)Smo是通過蛋白酶體途徑實現(xiàn)

14、的。
　　3.沉默果蠅體內(nèi)Eff/Uba1的表達可以增加Smo和Ci在翅盤中的聚集。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達果蠅體內(nèi)的CG9153以劑量反應的趨勢下調(diào)Smo在翅盤中的聚集程度。
　　主要結論:
　　CG9153通過與Smo相互作用調(diào)控其泛素化水平。Uba1、Eff、 CG9153和Cul4形成泛素化復合體共同調(diào)節(jié)Smo的泛素化水平，四者缺一不可?？傊?，本研究鑒定出CG9153聯(lián)合Cul4共同調(diào)節(jié)Smo的泛素化水平，為深入