1、背景：
　　 巨噬細胞是動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展中最主要的細胞類型,與脂質(zhì)沉積及炎癥密切相關。循環(huán)中單核細胞募集至內(nèi)皮下是動脈粥樣硬化發(fā)生的最早期事件。單核細胞分化為巨噬細胞,吞噬大量含載脂蛋白B(apoB)且富含膽固醇的脂蛋白顆粒。在動脈粥樣硬化的早期階段,大部分被吞噬的膽固醇以膽固醇-脂肪酸酯的形式儲存,導致了巨噬細胞源性泡沫細胞的形成。當動脈粥樣硬化病變進一步進展,出現(xiàn)膽固醇酯含量的逐步下降,以及相應的非酯化的游離膽固

2、醇(free cholesterol,FC)含量的進行性增加。FC在細胞的大量蓄積,導致巨噬細胞凋亡和繼發(fā)性壞死,繼而引起病變壞死、斑塊破裂、血栓形成,最終導致臨床急性心血管事件發(fā)生。同時越來越多研究者發(fā)現(xiàn),在FC誘導凋亡發(fā)生前所觸發(fā)的炎癥反應是影響斑塊穩(wěn)定性、造成動脈粥樣硬化病變進展的另一重要因素。
　　 AS所致缺血性心臟疾病是中、老年人群發(fā)病和死亡的常見原因,探索能有效防治AS的措施一直是心血管疾病領域的研究熱點。AS是一

3、種多因素疾病,體內(nèi)多種因子均不同作用地參與其發(fā)生發(fā)展,其中,載脂蛋白A-I(apoA-I)和載脂蛋白E(apoE)被認為是該疾病的兩個保護性因子,二者均能通過多種途徑拮抗AS,且相互存在協(xié)同效應。通過重組apoA-I和apoE全蛋白質(zhì)(holoprotein)雖然能夠治療AS,但因二者均為大分子蛋白(分子量分別為28kD和34kD),故只能通過靜脈給藥,且制備不易、成本高昂,限制了其臨床應用。因此,通過研制分子量更小而功能上相當?shù)腶po

4、A-I模擬肽和apoE模擬肽用以治療AS及其相關性疾病,被認為是防治AS方面很有前景的新策略,且已取得了較大進展。然而,現(xiàn)有apoA-I模擬肽和apoE模擬肽在抗AS方面均存在各自的不足,這在一定程度上降低了二者的治療效應。于是有研究者利用天然apoA-I與apoE功能上的互補性,將apoE受體結(jié)合域與含有兩性螺旋結(jié)構(gòu)的apoA-I模擬肽共價結(jié)合,形成一種新型的具有雙結(jié)構(gòu)域的載脂蛋白嵌合模擬肽即Ac-He-18A-NH2。研究發(fā)現(xiàn)這種雙

5、結(jié)構(gòu)域的嵌合模擬肽可以促進成纖維細胞、HepG2細胞對低密度脂蛋白(LDL)的攝取、吸收和降解。進一步研究發(fā)現(xiàn)Ac-He-18A-NH2模擬肽在體內(nèi)具有抗炎及抗氧化的特性。在apoE基因敲除小鼠模型,靜脈注射該模擬肽,血漿膽固醇水平明顯下降。高膽固醇血癥兔靜脈注射Ac-He-18A-NH2后,不僅顯著降低了血漿膽固醇水平,而且通過降低血漿中過氧化氫脂質(zhì)、增加高密度脂蛋白(HDL)對氧磷酶濃度、誘導超氧陰離子形成從而對抗氧化應激、改善內(nèi)皮

6、功能,從而起到抗動脈粥樣硬化作用。
　　 目的：
　　 觀察載脂蛋白嵌合模擬肽Ac-He-18A-NH2對氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激下RAW264.7巨噬細胞膽固醇流出、凋亡及炎癥介質(zhì)釋放的影響,并探討其可能的作用機制。
　　 方法v
　　 RAW264.7巨噬細胞傳代后接種于細胞培養(yǎng)板,分為三組:(1)膽固醇流出檢測組:細胞種植于24孔板,用0.5μCi/孔3H-膽固醇和含50μg/ml oxL

7、DL共同孵育24小時之后,給予不同濃度的Ac-He-18A-NH2(0-100μg/ml)干預24h,收集細胞用液體閃爍計數(shù)法檢測膽固醇流出。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(Camp)含量,采用實時熒光定量PCR及Western blot檢測三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)、肝x受體α(LXRα)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的Mrna及蛋白表達;(2)凋亡檢測組:細胞種植于6孔板,50μg

8、/ml oxLDL處理RAW264.7細胞48小時后加入不同濃度的模擬肽Ac-He-18A-NH2(1、10、50、100μg/ml)和膽固醇流出促進劑β-環(huán)糊精(β-CD)或膽固醇流出阻斷劑布雷菲得菌素(BFA)共同孵育24小時。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀檢測細胞凋亡;分別通過試劑盒檢測caspase-3活性及細胞內(nèi)膽固醇含量;Western-blot檢測細胞bcl-2蛋白的表達;(3)炎癥反應組

9、:oxLDL刺激RAW264.7巨噬細胞,給予不同濃度的模擬肽Ac-He-18A-NH2(1-100μg/ml)干預,收集細胞,測定TNF-α分泌和Mrna表達水平。Western-blot檢測ABCA1及P-IκB蛋白濃度。EMSA檢測核因子-Κb(NF-Κb)活性。
　　 結(jié)果v
　　 1.模擬肽Ac-He-18A-NH2以濃度依賴及時間依賴方式促進巨噬細胞內(nèi)膽固醇流出。1、10、50、100μg/ml Ac-He-

10、18A-NH2干預24小時后,其介導的膽固醇流出率分別為12.04±1.65％、16.19±1.45％、26.93±4.37％和24.58±2.43％;50μg/mlAc-He-18A-NH2干預細胞不同時間,其介導的膽固醇流出率分別為10.86±1.46％(6 h),13.43±1.55％(12 h),20.58±1.34％(18 h),和26.93±4.37％(24 h)。
　　 2.Ac-He-18A-NH2以濃度依賴方式

11、增加細胞內(nèi)Camp水平,上調(diào)ABCA1、LXRα和PPARγmRNA和蛋白表達。
　　 3.加用Camp刺激劑8-Br-Camp,Ac-He-18A-NH2介導的膽固醇流出率明顯增加(26.93±4.37,35.81±2.73;P<0.05),ABCA1mRNA表達增加了66.67％。而加用PPARγ特異性抑制劑預處理細胞后,PPARγ的表達幾乎完全抑制,ABCA1和LXRα的表達也受到一定程度抑制,Ac-He-18A-NH2介

12、導的膽固醇流出率明顯減少(26.93±4.37,17.23±1.93;P<0.01)。
　　 4.OxLDL誘導的RAW264.7巨噬細胞的凋亡率隨著oxLDL濃度的增加和處理時間的延長而顯著提高。
　　 5.50μg/ml oxLDL處理細胞48小時后,加入不同濃度的模擬肽Ac-He-18A-NH2(1、10、50、100μg/ml)干預,細胞凋亡率以濃度依賴的方式逐漸減少。
　　 6.模擬肽Ac-He-18A

13、-NH2呈濃度依賴性的促進細胞內(nèi)膽固醇流出和降低細胞內(nèi)的膽固醇含量,降低caspase-3的活性,上調(diào)bcl-2的蛋白表達。
　　 7.β-CD與Ac-He-18A-NH2共同作用后膽固醇流出明顯增加,細胞凋亡率相應減少。而通過BFA部分阻斷介導的膽固醇流出,細胞凋亡率明顯增加。
　　 8.OxLDL刺激使RAW264.7巨噬細胞TNF-α分泌和Mrna表達明顯增強,細胞內(nèi)膽固醇蓄積,促進IκB磷酸化,并激活NF-Κb。

14、
　　 9.Ac-He-18A-NH2濃度依賴性降低TNF-α分泌及Mrna表達,上調(diào)ABCA1Mrna和蛋白的表達,減少細胞內(nèi)膽固醇含量,抑制NF-Κb活化,并抑制IκB磷酸化。相同的實驗條件下及作用濃度,D-4F對于TNF-α分泌的抑制作用不如Ac-He-18A-NH2。
　　 10.與oxLDL刺激組比較,50μg/ml Ac-He-18A-NH2使上清TNF-α濃度降低56％,其Mrna表達降低67％,細胞內(nèi)膽固

15、醇含量降低65％,ABCA1 Mrna和蛋白表達均明顯上調(diào),NF-Κb活性減少65.34％,胞漿中IκB-α蛋白水平明顯升高,而p-IκB-α僅蛋白水平明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.模擬肽Ac-He-18A-NH2可以明顯促進巨噬細胞膽固醇流出,其機制可能與Camp-ABCA1和PPARγ-LXRα-ABCA1兩種途徑有關。
　　 2.模擬肽Ac-He-18A-NH2可以明顯抑制oxLDL誘導的巨噬細胞膽固