1、目的:
　　研究一種組蛋白去甲基化酶的microRNA調(diào)控機制,從而豐富人們對于microRNA分子參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的認識,為microRNA作為一種潛在的腫瘤治療靶位提供一定的參考。
　　方法:
　　1.在組織水平上,用實時定量PCR方法檢測了20對(肝癌組織和肝正常組織)標本中has-microRNA-212的水平,和先前檢測的RBP2在這些組織中的表達水平進行對比分析,初步確定兩者之間的相關性。還在這些組

2、織中檢測了已知的RBP2下游的靶分子p27kipl和pl6ink4a mRNA的表達水平,進一步分析has-microRNA-212,RBP2,p27kipl和p16ink4a這幾個分子之間的相關性。
　　2.在分子水平上,應用has-microRNA-212的高表達質粒和抑制質粒處理肝癌細胞,檢測其對RBP2在mRNA和蛋白水平表達的影響,以及這些處理對RBP2下游的靶分子細胞周期依賴性激酶抑制劑(CDKI)p27kipl和p1

3、6ink4a的表達水平的影響。同時也檢測了has-microRNA-212的高表達質粒和抑制質粒處理后,肝癌細胞的衰老表現(xiàn)和增殖狀況,進一步確定has-microRNA-212通過調(diào)控RBP2所引起的生物學效應。最后通過熒光素酶報告基因分析的方法,檢測了has-mieroRNA-212對于RBP2分子mRNA的3’-UTR的作用。具體方法如下:
　　(1).利用羅氏轉染試劑把has-microRNA-212的高表達質粒和抑制質粒以

4、及各自的對照質粒轉入肝癌細胞系HepG-2和SMMC-7721中,48小時后收細胞,用Trizol提取總RNA,再用ABI公司microRNA反轉錄專用試劑盒反轉錄RNA后用該公司的專用熒光定量PCR試劑盒檢測質粒的轉染效率。同時用實時定量PCR檢測RBP2及其調(diào)控的p27kipl和p16ink4a mRNA的表達水平。RBP2蛋白水平的變化用Western Blot方法分析。
　　(2).has-microRNA-212的高表達

5、質粒及其對照質粒被轉入肝癌HepG-2和SMMC-77212胞中48小時后,經(jīng)3%甲醛固定細胞后,進行衰老相關的β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal staining),檢測細胞衰老情況。
　　(3).has-microRNA-212的高表達質粒及其對照質粒被轉入肝癌HepG-2和SMMC-7721細胞中48小時后,進行細胞計數(shù),從每組取300個細胞,放入孵箱培養(yǎng)2周后,進行克隆計數(shù),即進行克隆形成實驗檢測細胞增殖能力的大小。

6、r>　　(4).回復實驗:先向HepG-2細胞中轉入has-microRNA-212的高表達質粒及其對照質粒,24小時后再向細胞中轉入RBP2高表達質粒及其對照質粒,48小時后用克隆形成實驗檢測細胞增殖能力。
　　先向SMMC-7721細胞中轉入has-microRNA-212的抑制質粒及其對照質粒,24小時后再向細胞中轉入RBP2特異性干擾RNA及其陰性對照序列,48小時后用克隆形成實驗檢測細胞增殖能力。
　　(5).把h

7、as-microRNA-212的高表達質粒和帶有RBP23’-UTR和預測結合位點突變的熒光素酶報告基因分別共轉染肝癌細胞系,檢測has-microRNA-212對于RBP23’-UTR是否為直接的結合而發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3.在整體動物水平驗證has-microRNA-212對于RBP2的調(diào)節(jié)作用從而達到干預腫瘤發(fā)生和生長的效果。把10只7周齡的裸鼠平均隨機分成兩組,每組5只。其中一組注射轉染has-microRNA-212高表

8、達質粒48小時后的HepG-2細胞,注射量為1×106個細胞/只。對照組注射轉染對照質粒48小時后的HepG-2細胞,注射量和前一組相同。觀察每組裸鼠腫瘤的形成和生長情況。5周后麻醉處死裸鼠后,分離腫瘤組織,一半凍于-80度冰箱以用于RNA水平檢測has-mieroRNA-212和RBP2的表達,另一半浸泡于中性福爾馬林以制作石蠟切片,做免疫組化檢測RBP2的表達。
　　結果:
　　1.組織水平檢測中,在mRNA水平,RBP

9、2的表達在肝癌組織中比肝正常組織中顯著升高,且has-microRNA-212的表達和正常組織相比,其在肝癌組織中明顯表達下調(diào)。此外,p27kipl和p16ink4a則在肝癌組織中表現(xiàn)出較低的表達水平。
　　2.肝癌HepG-2和SMMC-7721細胞中轉入has-microRNA-212高表達質粒48小時,RBP2的mRNA和蛋白表達都顯著下降,同時由于RBP2表達的降低,其下游的p27kipl和p16ink4a表達出現(xiàn)升高現(xiàn)象

10、。
　　3.肝癌HepG-2和SMMC-7721細胞中轉入has-microRNA-212的抑制質粒48小時,RBP2的mRNA和蛋白表達都顯著上升,同時由于RBP2表達的增高,其下游的p27kipl和p16ink4a表達出現(xiàn)降低現(xiàn)象。
　　4.衰老相關的β-半乳糖苷酶染色表明,在肝癌細胞系中轉has-microRNA-212高表達質粒48小時后,細胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。
　　5.克隆形成實驗表明,在肝癌細胞系中轉入h

11、as-microRNA-212高表達質粒48小時后,細胞的克隆形成能力明顯受到抑制。
　　6.回復實驗表明,在HepG-2中轉入RBP2高表達質粒能逆轉由于has-microRNA-212高表達質粒所誘導的細胞克隆形成能力的降低。在SMMC-7721中轉入RBP2干擾RNA也能逆轉由于has-microRNA-212的抑制質粒的所誘導的克隆形成能力的增強。
　　7.has-microRNA-212高表達質粒和帶有RBP23’

12、-UTR的熒光素酶報告基因的質粒共轉染對比于其對照質粒的共轉染,熒光素酶活性顯著降低。而has-microRNA-212高表達質粒和帶有預測結合位點突變的RBP23’-UTR的熒光素酶報告基因共轉染,相比于has-microRNA-212高表達質粒和帶有正常的RBP23’-UTR的熒光素酶報告基因共轉染,熒光素酶活性則有很大程度上升,即熒光素酶活性得到回復。
　　8.注射有轉入has-microRNA-212高表達質粒的HepG.

13、2細胞的裸鼠相對于注射轉入對照質粒細胞的裸鼠,它們的腫瘤發(fā)生率明顯降低,腫瘤體積的大小也明顯下降,腫瘤系數(shù)(腫瘤重量/裸鼠體重)也明顯下降。實時定量的結果顯示has-microRNA-212高表達組裸鼠腫瘤組織中的RBP2明顯降低。免疫組化顯示has-microRNA-212高表達組裸鼠腫瘤組織中的RBP2蛋白表達也明顯降低,而其下游的p21CIP2 and p27kipl表達卻有上升的現(xiàn)象。而且連續(xù)切片免疫組化顯示,腫瘤組織中RBP2