1、研究背景及目的:
　　 原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，預后很差，發(fā)現(xiàn)時多屬晚期，五年生存率較低，目前的放化療及手術(shù)均效果不佳，探索新的肝癌治療手段具有重要價值。
　　 真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors，eIFs)在真核細胞翻譯起始階段有重要作用。該家族的eIF4E可特異性地與mRNA5'

2、帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppN)結(jié)合并調(diào)節(jié)mRNA翻譯表達，高表達于多種實體腫瘤細胞(如頭頸部鱗癌、喉癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌、胃癌、膽管癌、結(jié)腸癌等)，其高表達水平與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。
　　 小分子干擾RNA(small interferencing RNA，siRNA)具有特異、高效沉默靶基因的特點，有望成為腫瘤治療最有前景的特異性基因藥物[2]。
　　 PAMAM-Dendrimer(聚酰胺

3、-胺型樹枝狀分子，PAMAM-D)是一種新型納米載體，呈樹枝狀結(jié)構(gòu)，其外層端基-NH2可質(zhì)子化成為-NH3+，表面攜帶正電荷，能與天然狀態(tài)下存在的帶負電荷的生物活性物質(zhì)發(fā)生靜電相互作用，形成復合物。具有攜帶量大、攜帶力強、透過細胞膜能力更強、緩釋性更好、對人體毒性更小等多方面的優(yōu)點，比以往采用的PLGA等納米載體更有優(yōu)勢[3]。
　　 本研究在體外設(shè)計合成針對eIF4E基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)，篩選出沉默該基因表達的有效

4、片斷，利用對人體毒性較小的新型納米載體聚酰胺-胺型樹狀高聚物PAMAM-D攜帶該shRNA分子，并將其導入細胞。在人肝癌細胞水平觀察該納米載體介導的針對eIF4E的shRNA(PAMAM-eIF4E-shRNA納米微粒)對肝癌細胞eIF4E基因表達的影響，及其對肝癌細胞的抑制作用，為開發(fā)新的抗肝癌基因藥物提供思路。
　　 實驗方法：
　　 一、檢測eIF4E在肝腫瘤細胞和人肝癌組織中的差異表達
　　 Wester

5、n Blot法檢測人正常成熟肝細胞、人肝腫瘤細胞株HepG2、Hep3B、Huh7中eIF4E蛋白的表達情況。免疫組織化學法檢測46組人肝癌組織及其癌旁組織中eIF4E的蛋白表達水平。
　　 二、構(gòu)建針對eIF4E的PAMAM-eIF4E-shRNA載體復合物
　　 用RNAi設(shè)計軟件，從人eIF4E mRNA編碼區(qū)(GenBankNMBC035166)的起始密碼子(AUG)下游尋找兩條以“AA”開始的二聯(lián)序列，設(shè)計合成

6、長度為2Ints的兩條序列，并設(shè)計一對非特異性序列作為對照，與人類基因組進行BLAST比對，驗證其均為單一基因。合成以上寡核苷酸DNA單鏈，然后退火連接形成雙鏈shRNA。
　　 室溫下，不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，分別加入shRNA和PAMAM-D載體、shRNA和脂質(zhì)體，混合反應(yīng)后，分別得到PAMAM-shRNA和脂質(zhì)體-shRNA復合物。
　　 三、針對eIF4E的PAMAM-D-shRNA載體復合物轉(zhuǎn)染肝

7、癌細胞，檢測下調(diào)eIF4E表達對肝腫瘤細胞生物學特性(增殖和凋亡)的影響
　　 1、細胞培養(yǎng)
　　 37℃，5％CO2，將脂質(zhì)體-shRNA和PAMAM-shRNA復合物分別與肝癌細胞共育。
　　 2、Real Time PCR法檢測eIF4E mRNA表達
　　 抽提細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備eDNA，然后進行Real Time PCR擴增，在圖像分析儀上對RT-PCR結(jié)果采用儀器自帶軟件ABI Pri

8、sm7300 SDS Software進行圖像分析。
　　 3、噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力
　　 接種細胞，待細胞貼壁后分為兩組，分別加入脂質(zhì)體-shRNA和PAMAM-eIF4E-shRNA。實驗時每孔加MTT20ul，作用四小時。分別于加入shRNA后第1，2，3，4，5，6，7天進行MTT實驗。細胞相對抑制率(％)=(1-實驗組OD/對照組OD)×100％。
　　 4、流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡率

9、
　　 利用P1檢測細胞周期，用TUNEL法進行細胞凋亡率的流式細胞儀分析。
　　 四、統(tǒng)計學處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行處理，結(jié)果用x±SD表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為具有顯著性差異。
　　 實驗結(jié)果:
　　 一、eIF4E在肝腫瘤細胞株和肝癌組織中的表達較癌旁組織和正常肝組織的表達高
　　 1、Westem Blot法檢測人正常成熟肝細胞、

10、不同人肝腫瘤細胞株eIF4E基因表達，顯示各肝癌細胞株均有eIF4E蛋白的高表達，尤其在HepG2細胞株中表達水平最高。正常細胞L02也有eIF4E蛋白表達，但水平較低。
　　 2、免疫組織化學法檢測病理組織蠟塊46組，其中32組人肝癌組織eIF4E蛋白表達水平較癌旁組織高，6組無明顯差異，8組人肝癌組織中eIF4E蛋白表達水平較癌旁組織低。
　　 二、成功構(gòu)建針對eIF4E的PAMAM-D-shRNA載體復合物

11、　　 根據(jù)shRNA設(shè)計原則，合成特異性DNA片段。然后退火，合成轉(zhuǎn)錄DNA模板，轉(zhuǎn)錄，純化。將合成的shRNA與PAMAM-D載體以1μg shRNA：0.65μg PAMAM-D的比例共育，兩者通過靜電作用結(jié)合，形成PAMAM-eIF4E-shRNA載體復合物。
　　 三、下調(diào)eIF4E表達抑制肝腫瘤細胞增殖
　　 1、Real Time PCR法檢測eIF4E mRNA表達
　　 同樣的條件下，PAMAM

12、-eIF4E-shRNA組對肝癌細胞HepG2的eIF4E基因表達水平下調(diào)作用更強，推測PAMAM-D作為shRNA的載體具有更高的轉(zhuǎn)染效率。
　　 2、噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力
　　 MTT實驗的第1，2，3，4，5，6，7天，P均＜0.05，表示差異有有統(tǒng)計學意義，PAMAM-eIF4E-shRNA組對肝癌細胞有更高的抑制率。
　　 3、PI檢測細胞周期
　　 S期，PAMAM-D介導組的細胞凋

13、亡率較脂質(zhì)體介導組明顯增高，PAMAM-eIF4E-shRNA對肝癌細胞有更高的抑制率。
　　 4、凋亡細胞的TUNEL的流式細胞儀分析
　　 TUNEL法檢測細胞，PAMAM-eIF4E-shRNA組細胞凋亡指數(shù)高于脂質(zhì)體組。P為0.013，P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、在HepG2等肝癌細胞株及大部分人肝癌組織中，eIF4E表達水平明顯增高。
　　 2、PAMA