1、酚氧化酶(phenoloxidase,EC.1.14.18.1,PO),又稱(chēng)酪氨酸酶,在昆蟲(chóng)的正常發(fā)育過(guò)程中具有重要的生理作用。它主要參與表皮的硬化、黑化過(guò)程；參與對(duì)外來(lái)侵染物的免疫防御反應(yīng)；參與傷口愈合反應(yīng)。研究酚氧化酶的特性及其在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的活性變化和生理功能對(duì)開(kāi)發(fā)以酚氧化酶為靶標(biāo)的新型害蟲(chóng)控制劑具有重要的理論意義。本文在前人的研究基礎(chǔ)之上,以黃粉蟲(chóng)和小菜蛾為材料,研究了酚氧化酶在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的活性變化、生理學(xué)意義及免

2、疫學(xué)功能。 1.為了本研究的簡(jiǎn)便易行,首先比較了傳統(tǒng)的紫外分光光度計(jì)比色法與酶標(biāo)儀微量法在測(cè)定酚氧化酶活性和蛋白質(zhì)含量方面的異同。研究發(fā)現(xiàn),兩者都能準(zhǔn)確地測(cè)定酚氧化酶的活性和蛋白質(zhì)含量,但是相比而言,酶標(biāo)儀微量法更簡(jiǎn)捷、方便、靈活,對(duì)試劑的消耗更少,重復(fù)性更穩(wěn)定。 2.研究了黃粉蟲(chóng)蛻皮后血淋巴和體壁中的酚氧化酶活性變化。剛完成蛻皮過(guò)程的幼蟲(chóng)血淋巴中PO活性較高,但隨著蛻皮后時(shí)間的延長(zhǎng),其活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在3～4小時(shí)內(nèi)達(dá)

3、到最低點(diǎn),而后PO活性逐漸上升,7小時(shí)的酶活性上升至最高,并接近于正常幼蟲(chóng)；在剛蛻完皮后的1小時(shí)內(nèi),體壁PO活性基本沒(méi)有變化,但隨后即開(kāi)始下降,3小時(shí)左右降到最低點(diǎn),然后開(kāi)始回升,6～7小時(shí)左右恢復(fù)到正常水平,并趨于穩(wěn)定；通過(guò)雙倒數(shù)曲線(xiàn)做圖法求得黃粉蟲(chóng)血淋巴PO的Km=1.176mmol/L,體壁PO的Km=0.881mmoI/L,表明血淋巴和體壁中的酚氧化酶可能是不同的同工酶,體壁PO催化能力要高于血淋巴PO。 3.研究了抑制

4、劑槲皮素對(duì)黃粉蟲(chóng)血淋巴酚氧化酶的生理效應(yīng)。結(jié)果表明,在離體條件下,槲皮素對(duì)黃粉蟲(chóng)血淋巴PO的IC50為0.625 mmol/L;在活體情況下,當(dāng)槲皮素-DMSO溶液或槲皮素水懸浮液(5 μL)注入蟲(chóng)體后,在濃度低于1 mmol/L時(shí)對(duì)黃粉蟲(chóng)血淋巴PO具有激活作用,當(dāng)濃度高于2 mmol/L時(shí)則對(duì)PO具有明顯的抑制作用：?jiǎn)为?dú)注射5 μL DMSO溶液對(duì)PO活性亦有一定的激活作用,但是注射水對(duì)酚氧化酶活性沒(méi)有影響。試蟲(chóng)被注射不同濃度的槲皮素

5、后,PO活性在2～4 h內(nèi)迅速下降,然后緩慢上升,處理后8 h左右達(dá)到最高點(diǎn),其后低濃度處理PO活性保持不變,而高濃度處理則逐漸下降,表明低濃度槲皮素可以在一定程度上引起試蟲(chóng)的免疫反應(yīng)。在PO測(cè)活體系中加入0.5％的牛血清蛋白(BSA)后對(duì)PO活性無(wú)影響,并能使槲皮素在測(cè)活體系中保持穩(wěn)定。 4.以大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株為免疫刺激因子,研究了黃粉蟲(chóng)在受到細(xì)菌侵染后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)及酚氧化酶活性變化。

6、結(jié)果表明,大腸桿菌水懸浮液與黃粉蟲(chóng)血淋巴一起冰浴后,其血淋巴酚氧化酶活性明顯上升,大約為對(duì)照的2.4倍；將血淋巴進(jìn)行離心除去血細(xì)胞后與E. coli-起冰浴,則不能使酚氧化酶活性升高；但是將離心后的血淋巴與胰蛋白酶一起冰浴,隨著胰蛋白酶濃度的升高,酚氧化酶活性也逐漸升高,說(shuō)明血漿中有酚氧化酶酶原(PPO)存在；綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,認(rèn)為黃粉蟲(chóng)體內(nèi)對(duì)入侵病原菌E.coli起識(shí)別作用的識(shí)別因子存在于血細(xì)胞或其它大分子的表面,這些細(xì)胞或大分子在離

7、心過(guò)程中被除去,因而血漿與E. coli冰浴后不能啟動(dòng)PPO級(jí)聯(lián)反應(yīng),即不能使酚氧化酶活性升高。將病原菌E. coli采用注射法注入黃粉蟲(chóng)體內(nèi)1小時(shí)后,黃粉蟲(chóng)體內(nèi)很快出現(xiàn)黑色的結(jié)節(jié)(nodules),表明很快就發(fā)生了免疫防御反應(yīng),10小時(shí)后結(jié)節(jié)數(shù)量達(dá)到最高峰,嚴(yán)重時(shí)大量的結(jié)節(jié)可聯(lián)結(jié)成片；在結(jié)節(jié)形成的同時(shí),黃粉蟲(chóng)血淋巴酚氧化酶的活性亦發(fā)生變化,在E. coli注入的初期,酚氧化酶活性大幅下降,12小時(shí)左右達(dá)到最低點(diǎn),然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),酚

8、氧化酶活性逐漸恢復(fù),20小時(shí)左右恢復(fù)到正常水平,說(shuō)明酚氧化酶參與了結(jié)節(jié)的形成。 5.研究了經(jīng)丁烯氟蟲(chóng)腈抗性篩選后抗性小菜蛾與敏感小菜蛾酚氧化酶活性的變化。結(jié)果表明：無(wú)論是抗性品系還是敏感品系,其酚氧化酶都有相近的Km值,分別是1.108mmol/L和1.114mmol/L,但最大反應(yīng)速度有明顯的差別,抗性品系PO的最大反應(yīng)速度為153.84 μmol/L·min-1·mg-1蛋白,敏感品系PO的最大反應(yīng)速度為67.114μmol

9、/L·min-1·mg-1蛋白,抗性品系是敏感品系的2.29倍；抗性品系和敏感品系酚氧化酶的最適pH均為6.5,并且均在pH 7.0處最為穩(wěn)定；抗性品系酚氧化酶在pH=5.5的環(huán)境下較敏感品系酚氧化酶穩(wěn)定,兩者在pH=4.4的環(huán)境下均不穩(wěn)定,且蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性而產(chǎn)生沉淀；兩者具有相似的溫度穩(wěn)定性,即在25～40℃范圍內(nèi)相對(duì)較為穩(wěn)定,溫度高于40℃時(shí)活性明顯下降。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明,抗性品系與敏感品系相比較具有較高的酚氧化酶活性,酚氧化酶可能對(duì)昆

10、蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生具有重要的貢獻(xiàn)。 6.以5種不同類(lèi)型與4種不同作用機(jī)制的殺蟲(chóng)劑為脅迫因子,研究了其在亞致死劑量下對(duì)黃粉蟲(chóng)血淋巴酚氧化酶活性的影響：氨基甲酸酯類(lèi)的滅多威與沙蠶毒素類(lèi)的殺蟲(chóng)單對(duì)酚氧化酶的活性影響相似,即在較高的劑量濃度下可提高酚氧化酶活性,而低劑量濃度下對(duì)酚氧化酶活性無(wú)明顯影響；有機(jī)磷類(lèi)的毒死蜱在亞致死劑量下可降低酚氧化酶的活性；擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)的高效氯氰菊酯在亞致死劑量下對(duì)酚氧化酶活性無(wú)影響；昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類(lèi)的除蟲(chóng)脲在亞致