1、目的：觀察人腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，ADM)對(duì)體外培養(yǎng)的活化正常大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)增殖及其細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步探討ADM對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制，以期為臨床預(yù)防和治療肝纖維化提供理論依據(jù)。 方法：大鼠肝星狀細(xì)胞系(HSC-T6，其表型為活化的HSC)以10％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基、37℃、5％CO2常規(guī)培養(yǎng)。預(yù)先將ADM0.1mg(合1.6586×10-8mol)溶于10

2、ml培養(yǎng)基(合1.6586×10-4mol/L)，備用。 1.MTT檢測(cè)HSC-T6增殖：取生長(zhǎng)良好的HSC-T6，經(jīng)0.25％胰酶消化，用培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。接種在96孔板中的細(xì)胞待24h后細(xì)胞貼壁，換用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基同步化處理24h后，加入ADM作用，根據(jù)作用時(shí)間不同分組如下：Ⅰ組(12h組)；Ⅱ(24h組)；Ⅲ(48h組)；Ⅳ組(Oh組即Oh對(duì)照組)。各組又根據(jù)加入ADM量不

3、同分組如下：A、B、C、D組，分別加入200 μL含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的細(xì)胞懸液(ADM為0，即ADM對(duì)照組)；加入ADM液及細(xì)胞懸液共200μL使ADM終濃度達(dá)10-7mol/L；加入ADM液及細(xì)胞懸液共200μL使ADM終濃度達(dá)10-8mol/L；加入ADM液及細(xì)胞懸液共200μL使ADM終濃度達(dá)10-9mol/L另設(shè)V(空白對(duì)照組)：上酶標(biāo)儀檢測(cè)前，只加入含100 mL/L的胎牛血清的RPMI-16

4、40培養(yǎng)液200μL(不含細(xì)胞)。ADM作用后，每孔加入MTT液反應(yīng)，再加入二甲基亞砜(DMSO)，后用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)的吸光度(A490)值。細(xì)胞抑制率(CPIR)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A490值/對(duì)照組平均A490值)×100％。 2．免疫細(xì)胞化學(xué)法(SABC法)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)增殖核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)，細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和細(xì)胞周期素依賴(lài)性

5、激酶抑制因子P21wafl的表達(dá)。取生長(zhǎng)良好的HSC-T6，經(jīng)0.25％胰酶消化，用培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞待24h貼壁后，換用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基同步化處理24h后，加入ADM作用，根據(jù)作用時(shí)間不同分組為：Ⅰ組(12h組)；Ⅱ(24h組)；Ⅲ(48h組)。 又根據(jù)加入的ADM的量不同分組如下：A、B組，分別加入含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的細(xì)胞懸液1mL(ADM為0

6、，即ADM對(duì)照組)；加入ADM液和細(xì)胞懸液使總量達(dá)1mL使其終濃度達(dá)ADM10-7mol/L。各組分別作用后，分別加入4％多聚甲醛室溫固定，加入0.3％Triton X-100作用，加入3％過(guò)氧化氫(H2O2)作用，后按照SABC試劑盒操作(其中陰性對(duì)照組加入蒸餾水代替一抗)，蘇木素復(fù)染，分化，梯度脫水，透明后用中性樹(shù)膠封片。 結(jié)果判定：胞核呈棕黃色為陽(yáng)性，并對(duì)染色后的細(xì)胞片進(jìn)行顯微鏡下觀察，攝片，Image-Pro Plus軟

7、件分析平均光密度，相對(duì)定量它們表達(dá)的強(qiáng)度。 結(jié)果： 1.MTT檢測(cè)ADM對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果：在12h，24h，48h時(shí)間點(diǎn)ADM10-7mol/L組(其A490值分別為：Ⅰ B組0.162±0.037，ⅡB組0.136±0.018，ⅢB組0.134±0.018)與相應(yīng)時(shí)間對(duì)照組(Ⅰ A組0.249±0.077，ⅡA組0.254±0.054，ⅢA組0.356±0.051)比較A490值明顯降低，差

8、異有顯著性(P<0.05：ⅠB vs ⅠA，t=10.646，ⅡB vs ⅡA，t=16.333，ⅢB vs ⅢA，t=24.516)，而其它濃度組與對(duì)照組比較差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。ADM10-7mol/L各實(shí)驗(yàn)組與Oh對(duì)照組(ⅣB組：0.195±0.052)相比差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05：ⅠB，ⅡB，ⅢB vs ⅣB，t值分別為4.003，4.543，4.857)，其12h，24h，48h抑制率逐漸增加，分別

9、是7.88％，17.58％，18.79％，ADM10-7mol/L組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)HSC-T6的A490值逐漸降低，抑制率逐漸增加，對(duì)其抑制作用逐漸加強(qiáng)，各時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較24h和48h組各與12h組相比差異有顯著性(P<0.05：ⅡB，ⅢB vs ⅠB，q值分別為3.857，3.951)，24h組與48h組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05：ⅡB vs ⅢB)。 2．免疫組化檢測(cè)HSC內(nèi)PCNA，cyclin D1，P21waf

10、l表達(dá)的結(jié)果： ①PCNA：細(xì)胞經(jīng)ADM 10-7mol/L濃度作用后，其PCNA蛋白表達(dá)明顯減弱，其胞核顏色明顯減淡，各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(其平均光密度值分別為：ⅠA組0.370±0.032，ⅡA組0.387±0.023，ⅢA組0.405±0.019)與相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組(IB組0.308±0.029，ⅡB組0.246±0.030，ⅢB組0.241±0.012)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05：ⅠA vs ⅠB．ⅡA vs ⅡB，ⅢA

11、vs ⅢB，t值分別是4.107，5.149，5.232)，各實(shí)驗(yàn)組時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較24h和48h組各與12h組相比差異有顯著性(P<0.05：ⅡB．ⅢB vsⅠ B，q值分別為5.100，6.633)，24h組與48h組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05：ⅡB vs ⅢB)。 ②cyclin D1：細(xì)胞經(jīng)ADM作用后其cyclin D1蛋白表達(dá)明顯減弱，其胞核顏色明顯減淡，各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組的平均光密度值分別為：ⅠA組0.450±0

12、.045，ⅡA組0.454±0.029，ⅢA組0.461±0.022，各相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的平均光密度值分別為：ⅠB組0.258±0.036，ⅡB組0.209±0.014，ⅢB組0.185±0.031，各對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05：ⅠA vs ⅠB，ⅡA vs ⅡB，ⅢA vs ⅢB，t值分別是4.807，5.572，6.039)，各實(shí)驗(yàn)組時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較24h和48h組與12h組差異無(wú)顯著性(P>0.05：ⅠB vs

13、 ⅡB vs ⅢB)。 ③P21wafl：細(xì)胞經(jīng)ADM作用后其P21wafl蛋白表達(dá)增加強(qiáng)，其胞核顏色明顯加深，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的平均光密度值(ⅠB組0.298±0.028，ⅡB組0.308±0.011，ⅢB組0.317±0.025)比對(duì)照組(ⅠA組0.195±0.034，ⅡA組0.201±0.033，ⅢA組0.212±0.029)明顯增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性(P<0.05：ⅠA vs ⅠB，ⅡA vs ⅡB，ⅢA vs ⅢB，

14、t值分別是4.721，5.299，4.036)，各實(shí)驗(yàn)組時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較差異無(wú)顯著性(P>0.05：ⅠB vs ⅡB vs ⅢB)。 ④ADM作用HSC后細(xì)胞內(nèi)PCNA，cyclin D1，P21wafl三者表達(dá)的相關(guān)性分析：PCNA和cyclin D1的變化呈直線相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.834，P<0.05)，具有正相關(guān)變化趨勢(shì)，PCNA和P21wafl變化呈直線相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.770，P<0.05

15、)，具有負(fù)相關(guān)變化趨勢(shì)，cyclin D1和P21wafl的變化呈直線相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-796，P<0.05)，具有負(fù)相關(guān)變化趨勢(shì)。 結(jié)論： ①腎上腺髓質(zhì)素在10-7mol/L濃度作用于體外培養(yǎng)HSC可以抑制其增殖率，在24小時(shí)內(nèi)呈時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)。 ②10-7mol/L濃度腎上腺髓質(zhì)素作用HSC后，HSC細(xì)胞內(nèi)PCNA，cyclin D1表達(dá)減弱，P21wafl表達(dá)增強(qiáng)。 ③10-7mol/L濃