1、第一部分熊果酸對(duì) T細(xì)胞NF-κB 核轉(zhuǎn)位及T細(xì)胞活化的作用
　　 目的：研究熊果酸對(duì)CD3、CD28 單抗促發(fā)的T細(xì)胞NF-κB 核轉(zhuǎn)位、T細(xì)胞活化的作用。
　　 方法：流式細(xì)胞儀分選獲取B6 小鼠T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、單抗刺激組及單抗刺激+熊果酸組。對(duì)照組僅加入T細(xì)胞，單抗刺激組同時(shí)加入2μg/ml 功能性CD3 抗體和1μg/ml 功能性CD28 單抗。熊果酸組在加入單抗前將T細(xì)胞同不同濃度（5μM、10μM和2

2、5μM）熊果酸孵育2 小時(shí)。單抗刺激24 小時(shí)后檢測(cè)p65核轉(zhuǎn)位程度；48 小時(shí)后檢測(cè)T細(xì)胞表面CD25、CD69表達(dá)情況以及培養(yǎng)上清中IL-2 水平。
　　 結(jié)果：經(jīng)流式細(xì)胞儀分選獲得純度＞95％的T細(xì)胞。單抗刺激24 小時(shí)后T細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65由0.23±0.02 上升至0.57±0.04（p＜0.05，VS 對(duì)照組），而5μM、10μM和25μM的熊果酸分別將其下調(diào)至0.50±0.01、0.41±0.02（p＜0.0

3、5，VS 單抗刺激組）和0.29±0.03（p＜0.05，VS 單抗刺激組）。25μM的熊果酸可將單抗刺激后T細(xì)胞表面的CD25下調(diào)92.4％（p＜0.01，VS 單抗刺激組），CD69下調(diào)89.3％（p＜0.01，VS 單抗刺激組）。單抗刺激24 小時(shí)后上清中IL-2 為1095.2±107.9ng/m（l p＜0.01，VS 單抗刺激組34.9±4.6ng/ml）。5μM、10μM和25μM的熊果酸分別將其下調(diào)至894.8±80.3

4、 ng/ml（p＜0.05，VS 單抗刺激組），650.2±62.2 ng/ml（p＜0.01，VS 單抗刺激組）和428.1±39.9 ng/ml（p＜0.01，VS 單抗刺激組）。
　　 結(jié)論：熊果酸劑量依賴(lài)性抑制CD3、CD28 單抗促發(fā)的T細(xì)胞NF-κB 核轉(zhuǎn)位和T細(xì)胞活化。
　　 第二部分 NF-κB 抑制劑熊果酸延長(zhǎng)小鼠心臟移植物存活時(shí)間
　　 目的：探討NF-κB 抑制劑熊果酸對(duì)小鼠心臟移植排斥反應(yīng)

5、的作用及其具體機(jī)制。
　　 方法：建立BALB/c（H2d）到C57BL/6 (B6，H2b)的小鼠腹部心臟移植模型。熊果酸用0.5％羧甲基纖維素鈉混懸，灌胃給藥，自手術(shù)前1天開(kāi)始給藥。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組及不同劑量熊果酸組。熊果酸分為3個(gè)劑量組，即10mg/(kg.day)、20mg/(kg.day)和30mg/(kg.day)。對(duì)照組使用相同劑量的0.5％羧甲基纖維素鈉灌胃。術(shù)后每天捫診心臟，觀(guān)測(cè)移植心存活時(shí)間。術(shù)

6、后7天獲取移植心，免疫組化檢測(cè)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)情況，實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)移植心中IFN-γmRNA、IL-4mRNA水平。
　　 結(jié)果：空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組移植心平均存活時(shí)間（MST）分別為7.4±0.3和7.8±0.5天，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。10mg/(kg.day)的熊果酸可將移植心MST 延長(zhǎng)至23.8±1.3天（p＜0.05，VS 溶劑對(duì)照組，n=5）。加大熊果酸劑量，移植心存活時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，20mg/

7、(kg.day)的熊果酸將移植心MST延長(zhǎng)至36.8±0.6天（p＜0.05，VS 溶劑對(duì)照組，n=5），30mg/(kg.day)的熊果酸使小鼠移植心MST 延至68.5±2.8天（p＜0.05，VS 溶劑對(duì)照組，n=5）。術(shù)后7天移植心HE 染色見(jiàn)熊果酸組（n=10）排斥明顯輕于對(duì)照組（n=5），免疫組化顯示熊果酸組CD4+T細(xì)胞（58±3個(gè)/高倍視野）及CD8+T細(xì)胞（76±4個(gè)/高倍視野）浸潤(rùn)數(shù)量明顯少于對(duì)照組（15±2個(gè)/高倍

8、視野和21±2個(gè)/高倍視野，p＜0.05和p＜0.05）。熊果酸組移植心內(nèi)IFN-γmRNA水平顯著下調(diào)，而IL-4mRNA 水平無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：熊果酸能顯著延緩?fù)N異體移植心排斥時(shí)間，這與熊果酸減少效應(yīng)性T細(xì)胞向移植物內(nèi)浸潤(rùn)及下調(diào)Th1 反應(yīng)相關(guān)。
　　 第三部分 NF-κB 抑制劑熊果酸聯(lián)合手術(shù)當(dāng)天DST誘導(dǎo)小鼠心臟移植耐受
　　 目的：探討NF-κB 抑制劑熊果酸聯(lián)合供者特異性淋巴細(xì)胞輸注（DST

9、）誘導(dǎo)小鼠心臟移植排耐受的可能性及其機(jī)制。
　　 方法：（1）一次心臟移植：采用BALB/c（H2d）到C57BL/6 (B6，H2b)的腹部心臟移植模型。耐受誘導(dǎo)方案：術(shù)前1天至術(shù)后14天灌胃給予20mg/(kg.day)的熊果酸，心臟移植成功后立即給予DST（1.0×107BALB/c 脾臟細(xì)胞，自眼球后輸入）。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組，熊果酸組，DST組，熊果酸聯(lián)合DST組。（2）二次心臟移植：采用頸部心臟移植。受體為移植心長(zhǎng)期存

10、活小鼠（long time survival，LTS）;供體分別為BALB/c和C3H。（3）過(guò)繼輸入：1×107B6 脾臟細(xì)胞→移植了BALB/c 心臟的RAG-/-；1×107LTS脾臟細(xì)胞→移植了BALB/c 心臟的RAG-/-；1×107B6 脾臟細(xì)胞+1×107LTS 脾臟細(xì)胞→移植了BALB/c 心臟的RAG-/-；1×10 排斥了BALB/c 心臟的B6 小鼠（Rej）脾臟細(xì)胞→
　　移植了BALB/c 心臟的RA

11、G-/-；1×107Rej 脾臟細(xì)胞→ LTS。（4）檢測(cè)術(shù)后 7天各組及LTS 脾臟細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+Teg比例。（5）INF-γ ELISPOT 檢測(cè)各組細(xì)胞抗原反應(yīng)性。
　　 結(jié)果：DST組小鼠MST 為8±0.7天，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差別（p>0.05，VS 對(duì)照組7.4±0.3天，n=5）。20mg/(kg.day)熊果酸將MST 延長(zhǎng)36.8±0.6天（p＜0.05，VS溶劑對(duì)照組，n=5）。熊果酸

12、聯(lián)合DST 可使84.6％的移植心存活時(shí)間超過(guò)150天。二次心臟移植時(shí)，LTS 可持續(xù)不排斥BALB/c 心臟（＞100天），而在14天內(nèi)排斥C3H 心臟。INF-γ ELISPOT顯示LTS 脾臟細(xì)胞對(duì)C3H 抗原反應(yīng)正常（p ＞ 0.05，VS 未做心臟移植的B6 脾臟細(xì)胞），而對(duì)BALB/c 抗原反應(yīng)性明顯降低（p＜0.05，VS 未做心臟移植的B6 脾臟細(xì)胞）。熊果酸聯(lián)合DST組術(shù)后7天時(shí)脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Te

13、g比例為6.5％（p ＞ 0.05，VS 對(duì)照組5.1％）。LTS 脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Teg 比例為4.9％（p ＞ 0.05，VS 對(duì)照組5.1％）。聯(lián)合移植LTS和B6 脾臟細(xì)胞時(shí),排斥心臟時(shí)間為13.7±1.5天，與單存輸注B6 脾臟細(xì)胞無(wú)明顯差異。LTS接受Rej 脾臟細(xì)胞后，排斥心臟時(shí)間為13.3±1.2天，與RAG-/-接受Rej 脾臟細(xì)胞后無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：短期應(yīng)用熊果酸聯(lián)合手術(shù)當(dāng)天DST