1、本研究立足于以往研究基礎，結合目前國內外的相關研究，在細胞和分子水平進一步探討調肝方藥加味四逆散治療效應的微觀物質基礎。實驗選用具有神經(jīng)元特性和功能的PC12 細胞，利用皮質酮 (Cort)、谷氨酸 (Glu)作用于體外培養(yǎng)的PC12細胞作為研究模型，體外模擬抑郁癥病人出現(xiàn)的高糖皮質激素(GC)水平及谷氨酸堆積狀態(tài)，運用中藥血清藥理學方法、流式細胞術、免疫熒光、免疫印跡等方法，針對慢性心理應激可導致對神經(jīng)細胞損傷這一關鍵問題，觀察調肝治

2、法方藥加味四逆散含藥血清的藥物學效應，從微觀方面闡明和揭示調肝治法方藥抗慢性應激致神經(jīng)細胞損傷的機理，為今后研制開發(fā)抗抑郁癥中藥新藥提供理論依據(jù)。 本研究分為四部分： 第一部分加味四逆散含藥血清對皮質酮、谷氨酸致PC12細胞損傷的保護作用 本部分實驗觀察調肝方藥加味四逆散(JWSNS)含藥血清對皮質酮、谷氨酸致PC12細胞損傷的保護作用。加味四逆散組方為柴胡5g、白芍15g、枳殼6g、枸杞子15g、山梔5g、干地

3、黃18g、石決明30g組成。實驗選用SPF級雄Wistar 大鼠，將動物隨機分為對照組、JWSNS低、中、高劑量組 (分別含生藥劑量0.846、1.69、3.384kg/L)。腹主動脈取血，分離制備含藥血清。用倒置顯微鏡對培養(yǎng)的PC12細胞、皮質酮、谷氨酸、JWSNS含藥血清作用PC12細胞24h后的細胞進行形態(tài)觀察，用形態(tài)學方法證明PC12細胞培養(yǎng)成功。采用100、200、400μmol/L Cort、10、50、100μmol/LG

4、lu及5％、10％ JWSNS含藥血清分別與PC12細胞共同孵育24h，以MTT法測定細胞存活率，觀察不同濃度皮質酮、谷氨酸及加味四逆散含藥血清對PC12細胞生長的影響，結果顯示100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/Lcort組細胞存活率分別為72.31％、53.85％、26.16％，10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 氨酸組細胞存活率分別為67.69％、43.32％、21.54％，不同濃度皮

5、質酮和谷氨酸對PC12細胞的生長均具有抑制作用，隨著皮質酮和谷氨酸的濃度升高，細胞存活率明顯降低，細胞損傷程度加重，與正常細胞對照組相比均有顯著性差異 (p<0.05-0.001)。5％JWSNS含藥血清低、中、高劑量組細胞存活率分別為86.76％、98.41％和94.11％，10％JWSNS含藥血清低、中、高劑量組細胞存活率分別為85.29、97.06％和89.71％， 50石、10％正常血清組細胞存活率分別為92.65％和88.24

6、％，與正常細胞對照組細胞存活率相比均無差異(p>0.05)。表明加味四逆散含藥血清對正常PC12胞無毒副作用。 第二部分加味四逆散含藥血清對皮質酮、谷氨酸誘導PC12 細胞凋亡的保護作用及對BDNF 蛋白表達的影響 本實驗用形態(tài)法、Annexin V/PI 雙標流式細胞術觀察加味四逆散含藥血清對皮質酮、谷氨酸誘導PC12細胞凋亡的影響。實驗分為正常細胞對照組、200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷模型組

7、、200μmol/LCort、50μmol/L G1u 損傷+10％JWSNS 含藥血清組、200μmol/L Cort、50μmol/L G1u 損傷+10％正常血清組。用吖啶橙(AO)和Hoechst33342(Ho)熒光染色觀察皮質酮、谷氨酸致PC12細胞凋亡的形態(tài)學變化；在熒光顯微鏡下可見AO染色后活細胞的細胞核呈亮綠色，死亡細胞的細胞核呈暗綠色，胞質整個呈暗綠色。Hoechst 33342染色后細胞核呈藍色，活細胞的藍色熒光最

8、強，而早期凋亡細胞藍色熒光較弱。以細胞萎縮、核固縮、染色質凝聚、凋亡小體形成和熒光強度增強等作為凋亡細胞指征，與正常組細胞相比，皮質酮和谷氨酸組細胞生長狀態(tài)較差，多見核染色質濃縮密集，邊緣化，形成深染團塊呈新月狀或戒指狀，位于核膜下，核破裂出芽形成凋亡小體等細胞凋亡的形態(tài)學表現(xiàn)及死亡細胞；含藥血清組細胞生長狀態(tài)較好，少見凋亡和死亡細胞形態(tài)。 采用Annexin V/PI雙標流式細胞術檢測PC12細胞凋亡率，可見正常細胞組細胞凋亡

9、率為(16.24±0.78)％，200μmol/LCort、50μmol/L G1u損傷模型組細胞凋亡率分別為(45.91±0.95)％，(39.58±0.7)％，與正常細胞對照組相比明顯升高(p<0.001)，表明皮質酮、谷氨酸可以誘導PC12細胞發(fā)生早期凋亡。200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷+10％JWSNS含藥血清組細胞凋亡率均下降，其中中劑量組細胞凋亡率分別為(28.99±1.20)％、(23.89±0.

10、35)％，高劑量組細胞凋亡率分別為(31.82±2.04)％、 (29.84±0.97)％，與200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷模型組比較差異有顯著性(p<0.05-0.01)，200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷+10％JWSNS 含藥血清組中、高劑量組細胞凋亡率明顯低于200μmol/LCort、50μmol/LGlu損傷+10％正常血清組(p<0.05-0.01)，表明加味四逆散含藥血清具

11、有減少皮質酮、谷氨酸誘導PC12細胞凋亡的作用。200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷+10％正常血清組細胞凋亡率與200μmol/LCort、50μmol/L G1u損傷模型組比較無顯著差異，表明正常大鼠血清無抗皮質酮、谷氨酸誘導PC12細胞凋亡的作用。 第三部分加味四逆散含藥血清對皮質酮、谷氨酸致PC12細胞胞內[Ca<'2+>]i的影響 本研究采用激光共聚焦顯微鏡觀察加味四逆散含藥血清對皮質酮、谷

12、氨酸致PC12細胞內[Ca<'2+>]i的影響。實驗分為正常細胞組、200μmol/L,Cort、50μmol/L G1u損傷模型組、200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷+含藥血清組，200μmol/LCort、50μmol/L G1u損傷+正常血清組。以Fluo-3/AM(5 u mol/L)探針裝載液，在激光顯微鏡下取不同視野選擇神經(jīng)細胞進行掃描。結果表明正常PC12細胞普遍為低熒光強度細胞，細胞內鈣離子濃度為5

13、3.6±7.9：200μmol/LCort、50μmol/L Glu 損傷模型組PC12細胞內鈣熒光強度明顯增強，分別達到134.9±12.1、162.3±5.3，胞內鈣離子濃度明顯升高(p<0.001)；與皮質酮、谷氨酸組相比，200μmol/LCort、50μmol/LGlu 損傷+含藥血清組細胞熒光強度均明顯減弱，并且弱于正常血清組，其中中劑量組細胞熒光強度值分別為64.7±4.8、69.7±6.7，與皮質酮、谷氨酸和正常大鼠血清

14、組相比有顯著性差異(p<0.01-0.001)。表明皮質酮、谷氨酸可致PC12細胞內鈣離子濃度升高，使PC12細胞內發(fā)生鈣超載；調肝方藥加味四逆散含藥血清具有緩解皮質酮、谷氨酸所致PC12細胞胞內鈣超載的效應。 第四部分加味四逆散含藥血清對轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白(CREB)及其磷酸化 (P-CREB)的影響 本研究采用免疫組織化學方法、Western blot法分別檢測加味四逆散含藥血清對CREB及其磷酸化(P

15、-CREB)的影響。 本研究采用了細胞和分子生物學方法探討了調肝方藥加味四逆散對細胞損傷模型PCI2細胞的保護效應，以證實肝主疏泄調暢情志功能的神經(jīng)生物學分子機制，研究結果提示，加味四逆散含藥血清對谷氨酸、皮質酮所致PC12細胞損傷具有顯著保護作用，可提高皮質酮、谷氨酸誘導凋亡的PC12細胞BDNF的表達，具有緩解皮質酮、谷氨酸所致PC12細胞胞內鈣超載的效應，以中劑量組效應最強。加味四逆散含藥血清能上調CREB的磷酸化水平，上