1、研究目的：
　　 本研究旨在明確Ihh和PTHrP雙信號(hào)在大鼠來源前軟骨干細(xì)胞中的表達(dá)情況；觀察Ihh-PTHrP信號(hào)軸對細(xì)胞生命活動(dòng)的影響；應(yīng)用通路阻斷和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法對Ihh和PTHrP信號(hào)的活性進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)，通過基因水平、蛋白水平及細(xì)胞生物學(xué)功能的檢測，試圖揭示Ihh-PTHrP雙信號(hào)單獨(dú)或協(xié)同作用下對前軟骨干細(xì)胞增殖、凋亡和分化的影響及其調(diào)控機(jī)制；同時(shí)對Ihh和PTHrP信號(hào)通路間的相互調(diào)節(jié)作用，以及通路可調(diào)控性、調(diào)控手

2、段和調(diào)控效果進(jìn)行較全面的評估。為構(gòu)建具有可調(diào)控生長與分化能力軟骨組織工程種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.應(yīng)用顯微外科技術(shù)分離出生后不同周齡大鼠的股骨干骺端組織，通過HE染色觀察大鼠干骺端軟骨組織結(jié)構(gòu)，用免疫組織化學(xué)染色觀察Ihh和PTHrP雙信號(hào)在不同發(fā)育程度干骺端軟骨組織中的表達(dá)和定位情況。
　　 2.應(yīng)用顯微外科和免疫磁珠篩選技術(shù)從大鼠軟骨膜La Croix環(huán)處獲得純化的前軟骨干細(xì)胞，

3、并經(jīng)免疫組化和免疫熒光進(jìn)行FGFR3和ColⅡ表型鑒定。
　　 3.應(yīng)用Hh信號(hào)通路特異性阻滯劑cyclopamine以不同濃度抑制Ihh信號(hào)，通過PTHrP真核質(zhì)粒（pEGPF-N1-PTHrP）轉(zhuǎn)染增強(qiáng)PTHrP信號(hào)；設(shè)立對照組、單信號(hào)干預(yù)組和雙信號(hào)干預(yù)組，研究Ihh-PTHrP雙信號(hào)對前軟骨干細(xì)胞的獨(dú)立或協(xié)同調(diào)控作用及機(jī)制。
　　 4.應(yīng)用細(xì)胞RNA提取及RT-PCR技術(shù)，檢測Hh蛋白家族以及Hh信號(hào)通路相關(guān)基

4、因（Ihh、Shh、Dhh、Ptch和Smo）在前軟骨干細(xì)胞中的表達(dá)情況；以及干預(yù)后信號(hào)通路相關(guān)基因（PTHrP、Ptch、Ihh、Smo）和增殖/凋亡相關(guān)基因（Bcl-2、p21）的表達(dá)變化；通過Western Blot檢測信號(hào)蛋白（Ihh、PTHrP）的表達(dá)變化。
　　 5.應(yīng)用MTT和BrdU摻入法檢測不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖和DNA合成情況，AnnexinV-PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　 6.應(yīng)用免疫組織

5、化學(xué)和阿爾辛藍(lán)染色法，觀察干預(yù)后前軟骨干細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)，觀察細(xì)胞的分化情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.免疫組化顯示，Ihh和PTHrP信號(hào)在大鼠干骺端發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)，且主要位于肥大軟骨細(xì)胞層和次級骨化中心內(nèi)。提示其活性與軟骨內(nèi)成骨過程中骨基質(zhì)的形成密切相關(guān)。
　　 2.成功獲得了性狀和表型一致的前軟骨干細(xì)胞，經(jīng)鑒定同時(shí)表達(dá)FGFR3和ColⅡ蛋白，符合前軟骨干細(xì)胞表型特點(diǎn)。
　　 3

6、.PCR結(jié)果顯示，Hh和PTHrP信號(hào)存在于PSCs中，且信號(hào)蛋白以Ihh亞型為主，Dhh和Shh表達(dá)微弱。阻斷Ihh信號(hào)后，觀察到前軟骨干細(xì)胞失去原有形態(tài)出現(xiàn)老化現(xiàn)象。
　　 4.經(jīng)PCR和MTT檢測，cyclopamine對于Ihh信號(hào)通路的抑制存在劑量和時(shí)間依賴關(guān)系；轉(zhuǎn)染pEGPF-N1-PTHrP質(zhì)粒后兩周，目的基因在細(xì)胞內(nèi)仍顯著表達(dá)。提示上述方式均可以有效調(diào)控Ihh和PTHrP信號(hào)的活性。
　　 5.在阻斷Ih

7、h信號(hào)的試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，PTHrP的基因和蛋白表達(dá)水平隨Ihh的下降而下降；而在過表達(dá)PTHrP的試驗(yàn)中卻發(fā)現(xiàn)Ihh的表達(dá)被抑制。提示Ihh可以促進(jìn)PTHrP的表達(dá)，而PTHrP對Ihh可產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。
　　 6.MTT和BrdU檢測發(fā)現(xiàn)，Ihh信號(hào)阻斷后前軟骨干細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制，AnnexinⅤ檢測提示其凋亡率增加，而過表達(dá)PTHrP信號(hào)不能糾正這一影響。提示Ihh信號(hào)的存在可促進(jìn)前軟骨干細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，

8、這一調(diào)節(jié)作用不依賴PTHrP的存在。
　　 7.通過基因表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，p21和Bcl-2可能參與介導(dǎo)Ihh對前軟骨干細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　 8.在細(xì)胞分化的研究中，Ihh信號(hào)抑制后和對照組比較ColⅡ的表達(dá)下降，ColⅩ表達(dá)升高，細(xì)胞外蛋白多糖的合成減少；而過表達(dá)PTHrP信號(hào)可以不依賴Ihh信號(hào)的存在發(fā)揮抑制前軟骨細(xì)胞過分化的作用。提示Ihh信號(hào)對前軟骨干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)是通過PTHrP信

9、號(hào)介導(dǎo)的，而后者可以獨(dú)立抑制前軟骨干細(xì)胞的分化。
　　 結(jié)論：
　　 通過上述研究，我們認(rèn)為Ihh和PTHrP信號(hào)通路參與大鼠長骨干骺端軟骨內(nèi)成骨過程。在軟骨膜來源的前軟骨干細(xì)胞中也存Ihh和PTHrP信號(hào)通路，兩者構(gòu)成Ihh-PTHrP信號(hào)軸，并通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制相互影響和制約，以獨(dú)立或協(xié)同的方式對細(xì)胞的增殖和分化發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。一方面，Ihh信號(hào)的存在可以促進(jìn)前軟骨干細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，這一作用不依賴PTHr