1、2005年，哈佛大學(xué)的Pan等在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞抗胞內(nèi)病原體的基因--胞內(nèi)病原體抗性基因1（intracellular pathogen resistance1，Ipr1），該基因與結(jié)核病的易感性有著密切的聯(lián)系。表達(dá)Ipr1基因的小鼠，感染Mtb后巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)菌不易增殖。而Ipr1基因缺陷的小鼠感染Mtb后巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為壞死，從而利于細(xì)菌在宿主體內(nèi)的增殖與擴(kuò)散。然而，Ipr1基因增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染

2、的機(jī)制還不清楚。 本課題通過(guò)RT-PCR法從C57BL/6J小鼠胸腺組織中獲取Ipr1基因，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Ipr1，觀察Ipr1基因在細(xì)胞水平調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抗分枝桿菌的作用。構(gòu)建Ipr1和綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）真核共表達(dá)穿梭質(zhì)粒pBGOI，然后將該穿梭質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到卡介苗BCG中，構(gòu)建可靶向遞送pBGOI質(zhì)粒進(jìn)入巨噬細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的重組卡介苗BCGi，并在細(xì)胞水平和小鼠

3、體內(nèi)觀察該重組卡介苗的表達(dá)。通過(guò)重組卡介苗BCGi靶向遞送Ipr1基因于感染Mtb的小鼠體內(nèi)，觀察重組卡介苗BCGi對(duì)小鼠Mtb感染的作用，運(yùn)用基因芯片技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)、Real-time PCR、ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組與免疫相關(guān)分子的表達(dá)差異，初步探討Ipr1基因在抗Mtb感染中的可能的作用機(jī)制。 第一部分Ipr1基因表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞抗分枝桿菌感染的影響。 目的：獲取Ipr1基因全長(zhǎng)編碼序列，構(gòu)建Ipr1基因與E

4、GFP基因融合表達(dá)載體，鑒定Ipr1基因在小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7中的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位，觀察Ipr1基因的表達(dá)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞體外殺傷結(jié)核分枝桿菌H37Ra作用的影響。 方法：從C57BL/6J小鼠胸腺組織提取總RNA，以RT-PCR法調(diào)取Ipr1基因編碼序列，克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-C1，獲得真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Ipr1，經(jīng)PCR、酶切鑒定正確后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP-Ipr1至小鼠巨噬細(xì)胞

5、株RAW264.7，采用RT-PCR法，Western blotting法分別在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平檢測(cè)Ipr1基因的表達(dá)及激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位。應(yīng)用G418壓力篩選穩(wěn)定表達(dá)Ipr1基因的小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞，獲得高表達(dá)Ipr1基因的巨噬細(xì)胞。體外感染分枝桿菌H37Ra，感染后24h及96h細(xì)胞裂解物細(xì)菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)（CFU）的方法觀察巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌H37Ra感染活性。 結(jié)果：從C5

6、7BL/6J小鼠胸腺組織內(nèi)擴(kuò)增出大小為1338bp片段。成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Ipr1，轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7，經(jīng)RT-PCR、Western blotting鑒定Ipr1基因在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平獲得表達(dá)，共聚焦顯微鏡觀察Ipr1融合綠色熒光蛋白表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核內(nèi)。經(jīng)G418壓力篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)Ipr1基因的RAW264.7細(xì)胞。細(xì)胞水平抗分枝桿菌H37Ra實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ipr1基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞裂

7、解物細(xì)菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)（CFU）低于對(duì)照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。 結(jié)論：成功獲取小鼠Ipr1基因全長(zhǎng)編碼序列，構(gòu)建了Ipr1基因與EGFP基因融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Ipr1，Ipr1基因表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核內(nèi)。G418壓力篩選出高表達(dá)Ipr1基因的細(xì)胞。體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明Ipr1基因的表達(dá)增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞殺傷胞內(nèi)吞噬的結(jié)核分枝桿菌H37Ra的能力。 第二部分靶向遞送pBGOI真核質(zhì)粒的重組BCGi的構(gòu)建及

8、鑒定。 目的：構(gòu)建Ipr1和綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）真核共表達(dá)穿梭質(zhì)粒pBGOI，并在人肺腺癌細(xì)胞株A549中進(jìn)行表達(dá)。構(gòu)建可靶向遞送pBGOI質(zhì)粒進(jìn)入巨噬細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的重組卡介苗BCGi，并在細(xì)胞水平和小鼠體內(nèi)觀察該重組卡介苗的表達(dá)。 方法：將GFP基因、分枝桿菌復(fù)制子OriM和Ipr1基因同時(shí)克隆入雙啟動(dòng)子真核共表達(dá)載體pBudCE4.1質(zhì)粒中，構(gòu)建pBOGI穿梭質(zhì)

9、粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pBOGI質(zhì)粒于培養(yǎng)的A549細(xì)胞中，RT-PCR法、免疫組化、Western Blotting、熒光顯微鏡檢測(cè)Ipr1和GFP的表達(dá).將pBGOI電轉(zhuǎn)入卡介苗BCG中，構(gòu)建重組卡介苗BCGi，PCR進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增，將BCGi導(dǎo)入RAW264，7細(xì)胞后作RT-PCR、Western Blotting檢測(cè)目的基因的表達(dá)。重組BCGi滴鼻方式免疫BALB/c小鼠，以RT-PCR法，免疫組化法檢測(cè)肺脾組織中目的基因的表達(dá)。

10、 結(jié)果：酶切和測(cè)序分析表明pBGOI真核共表達(dá)穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功.pBGOI轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，RT-PCR、Western Blotting法檢測(cè)到目的基因的表達(dá)。熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有綠色熒光蛋白表達(dá)，免疫組化可以檢測(cè)到Ipr1蛋白的表達(dá)。菌落PCR鑒定重組卡介苗BCGi構(gòu)建成功，BCGi導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)到目的基因的表達(dá)。重組BCGi滴鼻免疫的方式免疫BALB/c小鼠，RT-PCR法，免疫組化法檢

11、測(cè)到肺脾組織中目的基因的表達(dá)。 結(jié)論：成功構(gòu)建真核共表達(dá)穿梭質(zhì)粒pBGOI，成功構(gòu)建重組卡介苗BCGi，為進(jìn)一步研究Ipr1的功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 第三部分 Ipr1基因抗小鼠Mtb感染的作用及機(jī)制的初步探討。 目的：重組卡介苗BCGi靶向遞送Ipr1基因于感染結(jié)核分枝桿菌的小鼠體內(nèi)，觀察重組卡介苗BCGi對(duì)小鼠結(jié)核分枝桿菌感染的作用及可能的分子機(jī)制。 方法：用BCGi免疫感染了結(jié)核分枝桿菌Mtb的C

12、3HeB/FeJ小鼠，3周后處死，檢測(cè)肺脾器官荷菌量、肺脾病理學(xué)改變、以及Ipr1在肺組織的表達(dá)，并做小鼠肺組織基因芯片檢測(cè)、小鼠肺組織Real-time PCR檢測(cè)、小鼠血清細(xì)胞因子蛋白芯片檢測(cè)、小鼠血清IL-10、TNF-α和IFN-γ的檢測(cè)。 結(jié)果：重組BCGi組肺脾器官荷菌顯著降低。重組BCGi組小鼠肺組織病變范圍和程度輕于PBS組和BCG組。免疫組化檢測(cè)到小鼠肺組織中有Ipr1的表達(dá)。基因芯片結(jié)果中BCGi組比BCG組

13、上調(diào)2倍的基因有：Igh-6、Lbp、Ltf、Ly96、Ncf4、Nfkb1、Nfkb2、Nfkbia、Nos2、Prg2、Sftpd、Stabl、Tlr4。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fas、Mcl1、Bc12、Caspase3、iNOS、LRG47、NRAMP1基因上調(diào)。血清蛋白芯片結(jié)果，BCGi組比BCG組下調(diào)1.3倍的炎癥細(xì)胞因子有Eotaxin、Eotaxin-2、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-10、IL-17、