1、植物在一定的誘導因子(又稱激發(fā)子)作用下，產(chǎn)生對隨后病原菌侵染的抗性增強，這種現(xiàn)象稱為誘導免疫(induced immunity)。激發(fā)子本身沒有殺菌活性，但可以通過活化植物體內的免疫機制從而誘導植物產(chǎn)生抗性。近年來，一些微生物來源的蛋白類免疫誘導因子引起人們的廣泛關注。這類激發(fā)子對植物無毒、作用劑量小、環(huán)境友好，因而在開發(fā)環(huán)境友好型作物病害免疫誘導劑中具有廣闊前景。本項目從稻瘟病菌中分離鑒定了1個免疫誘導蛋白基因MgSM1，采用農(nóng)桿菌

2、介導的瞬間表達技術以及轉基因技術研究了MgSM1蛋白的免疫誘導活性及其可能的機理。 根據(jù)其他微生物中SM1基因的序列信息，采用生物信息學方法克隆了稻瘟病菌的SM1基因cDNA，命名為MgSM1。MgSM1包含一個414bp的ORF，編碼一個138個氨基酸的蛋白，含有一個高度保守的Cerato-platanin(CP)的4個半胱氨酸二硫鍵。RT-PCR分析表明，MgSM1在稻瘟病菌侵染水稻過程中有明顯的表達；另外MgSM1基因在稻

3、瘟菌的整個生活史中都有表達。 為了研究MgSM1蛋白的免疫誘導活性，將MgSM1的ORF序列克隆到pFLAG-CTS1質粒上，形成C-末端與FLAG序列融合的重組蛋白，并將整個MgSM1-FLAG構建克隆進由DEX誘導表達型啟動子驅動目的基因表達的pINDEX3雙元質粒中。采用農(nóng)桿菌介導瞬間表達方法，分析了MgSM1在普通煙、本氏煙、番茄、擬南芥和水稻等不同植物上的免疫誘導活性。結果表明，在農(nóng)桿菌注射并經(jīng)DEX誘導處理后，供試植

4、物在短時間內(處理后6小時)注射葉片組織發(fā)生過敏性反應(hypersensitivity response，HR)，導致細胞死亡，組織崩潰。在普通煙、本氏煙、番茄、擬南芥和水稻等植物葉片上，MgSM1的瞬間表達可引起注射葉片中活性氧的產(chǎn)生，注射葉片的電導率升高，HR指示基因表達增強。這些結果說明，MgSM1可以在多種植物上引起HR反應。 為了明確MgSM1處理后，不同植物植株是否激活體內防衛(wèi)反應并提高抗病性，分析了MgSM1處理

5、植株體內防衛(wèi)基因的表達并測定了上部葉片的抗病性。RT-PCR結果表明，注射MgSM1并經(jīng)DEX誘導后，煙草、番茄、擬南芥和水稻植株的注射葉片PR基因表達上調，而且在注射葉片上部非注射葉片中PR基因也出現(xiàn)上調表達。這些結果說明，MgSM1作用后不僅激活了注射葉片局部組織的防衛(wèi)反應，而且也活化了未處理葉片組織中的防衛(wèi)反應。抗病性測定結果顯示，在注射MgSM1并經(jīng)DEX誘導處理的番茄中，上部未處理葉片上接種灰霉菌(Botrytis ciner

6、ea)后，病害程度明顯低于對照；同樣，在注射MgSM1并經(jīng)DEX誘導處理的擬南芥植株中，上部葉片上接種B.cinerea和Pseudomonas syringae pv.tomato(Pst)DC3000后，灰霉病病害癥狀和B.cinerea的生長量菌明顯低于對照，PstDC3000引起的病害癥狀和細菌菌量也明顯低于對照。這些結果說明，MgSM1作用后，通過激活植株體內的防衛(wèi)基因表達，提高了植株對多種病害的抗病性。 為了進一步研

7、究MgSM1在調控抗病反應中的功能，本研究將MgSM1基因導入擬南芥，經(jīng)抗性分離篩選和分子鑒定獲得3個單拷貝插入的過量表達MgSM1轉基因純合株系(＃2、＃7和＃11)。在未經(jīng)DEX處理時，MgSM1轉基因植株與野生型植株無明顯形態(tài)和發(fā)育上的差異。在DEX處理后，能檢測到MgSM1的表達，而且高濃度DEX處理時植株生長受到抑制，甚至死亡?？共⌒栽囼灡砻?，MgSM1轉基因擬南芥植株增強了對PstDC3000、B.cinerea和Alter

8、nariabrassicicola的抗性。接種PstDC3000后，MgSM1轉基因植株葉片中病害癥狀減輕，葉片中細菌數(shù)量比對照下降2個數(shù)量級；噴霧接種B.cinerea后，MgSM1轉基因植株病害明顯低于對照，B.cinerea生長量也明顯低于對照；離體葉片接種A.brassicicola后，MgSM1轉基因植株葉片上病斑顯著減小。RT-PCR分析表明，MgSM1轉基因植株經(jīng)DEX處理后，防衛(wèi)基因如PR-1、PDF1-2和PR-5等的

9、表達明顯上調，對照植株中防衛(wèi)基因表達沒有變化。染色檢測表明，DEX處理后MgSM1轉基因植株葉片內有顯著的過氧化氫和超氧陰離子等活性氧的產(chǎn)生與積累，而對照植株中則未檢測到活性氧的積累。這些結果證明，MgSM1作用后，能激活植株體內防衛(wèi)基因表達，并提高植株對多種病害的抗病性。 為了探索MgSM1在誘導抗病反應中可能涉及的信號途徑，比較了MgSM1在不同抗病信號突變體上誘導抗病反應的變化。MgSM1在npr1、fls2-100、Na

10、hG、ein2和jar1-1等突變體植株葉片上引起的壞死反應明顯強于其在野生型植株葉片上引起的壞死反應。MgSM1在NahG、npr1、ein2和jar1-1突變體上誘導防衛(wèi)基因表達和抗病反應能力下降，表明MgSM1的作用需要SA和JA/ET途徑的參與。但是，在fls2-100突變體中，MgSM1誘導防衛(wèi)基因表達和抗病反應能力與在野生型中相似，說明MgSM1的作用不需要FLS2的參與。 為了明確MgSM1蛋白中的活性部位，構建了

11、4個C-末端缺失的截斷片斷分子MgSM1-D1(缺失C端18個氨基酸)、MgSM1-D2(缺失C端38個氨基酸)、MgSM1-D3(缺失C端66個氨基酸)和MgSM1-D4(缺失C端84個氨基酸)，并用農(nóng)桿菌介導的瞬間表達方法分析了截斷分子的免疫誘導活性。結果表明：在擬南芥上，MgSM1-D1和MgSM1-D2具有與MgSM1全長片段相似的免疫誘導活性，并可誘導野生型擬南芥上的局部和系統(tǒng)性的PR基因表達，而MgSM1-D3和MgSM1-