1、慢性肝臟疾病是一類世界性的嚴重危害人類健康的主要疾病，其中肝纖維化是這個過程的中間及關鍵環(huán)節(jié)。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是啟動整個事件的開端，在肝纖維化過程中扮演著重要的角色，誘導活化HSC的凋亡可使肝纖維化發(fā)生逆轉。越來越多的研究認為HSC活化和增殖與其凋亡受到抑制有關，而核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)與細胞凋亡關系密切。NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕

2、鏈基因的增強子κB序列特異結合的蛋白因子，由Rel蛋白家族的成員以同源或異源二聚體形式組成，目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物的Rel蛋白包括p65(RelA，NF-κB3)、p50(NF-κB1)、Rel(c-Rel)、RelB和p52(NF-κB2)，其中p65/p50是發(fā)現(xiàn)最早的，分布最廣泛，主要發(fā)揮生理作用的NF-kB。NF-κB能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發(fā)生特異性結合而促進轉錄和表達，與炎癥反應、免疫應答以及細胞的增生、轉化和

3、凋亡等重要的病理生理過程密切相關。近年RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術的出現(xiàn)為抑制NF-κB的基因表達開辟了新的途徑。RNA干擾是指將與內源性mRNA互補的雙鏈RNA導入細胞后，引起該mRNA特異性降解，導致mRNA編碼的基因不能表達，發(fā)生基因沉默，提示我們可以通過RNA干擾技術沉默NF-κB的基因表達，從而使HSC的凋亡增加，減緩肝纖維化的進程。 目的：本實驗通過設計短發(fā)夾狀干擾RNA(short

4、hairpinRNA，shRNA)對NF-κBp65進行基因干擾，研究其對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活的肝星狀細胞凋亡的影響。 方法：體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞，進行以下分組：①空白對照組；②LPS組：經LPS處理；③陰性組：經陰性干擾RNA與LPS處理；④陽性組：經NF-κBp65 shRNA與LPS處理；⑤脂質體2000組：經脂質體2000與LPS處理。應用western blot檢測其NF-κBp

5、65、p50及IκBa的蛋白表達，反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chainreaction,RT-PCR)檢測NF-κBp65與I型前膠原mRNA的表達，流式細胞術、末段脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標記法(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測細胞凋亡

6、的變化，酶譜法測定明膠酶活性。 結果： 1.siRNA轉染HSC的效率： 將熒光素標記的對照siRNA轉染HSC，通過熒光顯微鏡觀察轉染效率，結果顯示33nmol/LsiRNA組轉染72小時效率最高，可達90％以上。 2.LPS激活HSC后細胞核中NF-κBp65蛋白的表達： western blot結果顯示同一濃度的LPS激活HSC后，HSC細胞核中NF-κBp65蛋白表達增加，于1小時細胞核中

7、NF-κBp65蛋白表達最高，并且濃度為1000ng/mlLPS激活HSC1小時后表達NF-κBp65蛋白增加(232.15％±5.28％)比100ng/mlLPS激活HSC后表達NF-κBp65蛋白增加(168.18％±3.39％)明顯。 3.NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后細胞核中NF-kBp65蛋白及mRNA的表達減低： western blot結果顯示陽性組HSC細胞核中NF-κBp65蛋

8、白的表達減低，24小時比LPS組減低72.41％±1.22％，48小時減低77.45％±1.23％，72小時減低86.34％±41.01％，于72小時減低最高，而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯減低。RT-PCR結果顯示，陽性組NF-κBp65 mRNA表達明顯減低，而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯減低。此結果說明實驗構建了針對大鼠HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543-1561的陽性shRNA，將其

9、轉染HSC有效地干擾了NF-κBp65的mRNA及蛋白發(fā)達，并于72小時干擾效率達到最高。 4 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC72小時后NF-κBp50和IκBa蛋白表達減低： western blot結果顯示經陽性組HSC細胞核中NF-κBp50蛋白的表達減低，LLLPS組減低75.45％±0.93％，而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯減低。陽性組細胞漿中IκcBa蛋白減低，比LPS

10、組減低70.61％±42.19％，而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯減低，說明NF-κBp65 shRNA轉染HSC后，干擾NF-κBp65的mRNA及蛋白發(fā)達的同時，NF-κBp50及IκBa蛋白表達隨之降低。 5 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后HSC凋亡增加： 流式細胞法結果顯示陽性組細胞凋亡較LPS組增加，凋亡率為15.40％±40.72％，而陰性組及脂質體2000組與LPS組

11、比較無明顯增加。TUNEL法結果顯示經陽性組HSC凋亡較LPS組增加，凋亡率為33.33％±1.06％，而陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯增加。 6 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后Ⅰ型前膠原mRNA表達減低： RT-PCR結果顯示，經陽性組Ⅰ型前膠原mRNA表達明顯減低，較LPS組減低56.84％±1.89％，而陰性組及脂質體2000組與LPSS組比較無明顯減低，表明經NF-κBp65 sh

12、RNA基因干擾后Ⅰ型前膠原mRNA表達減低。 7 NF-κBp65 shRNA基因干擾LPS激活的HSC后明膠酶活性增高： 酶譜法測定結果顯示，陽性組明膠酶活性明顯升高，陰性組及脂質體2000組與LPS組比較無明顯變化。 結論： 1.本實驗構建了針對HSC的NF-κBp65 mRNA靶序列1543-1561的陽性shRNA，將其轉染HSC，有效地干擾了NF-κBp65的基因發(fā)達，與此同時，NF-κB p5