1、目的：近年來，樹突狀細胞(dendritic cells，DC)已成為生物醫(yī)學界腫瘤生物免疫治療十分關注的研究熱點。DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強大的抗原提呈細胞(antigen-presenting cell，APC)，它是啟動、調控及維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)，對維持正常機體免疫系統(tǒng)自穩(wěn)態(tài)起重要作用，在機體的抗腫瘤免疫應答中處于核心地位。諸多研究證實，DC能在體外攝取腫瘤抗原，并在體內激活初始T淋巴細胞產生抗原特異性免疫反應，從而在腫瘤免疫中

2、發(fā)揮至關重要的作用。有研究表明腫瘤患者的DC，尤其是腫瘤組織中的DC存在著免疫功能缺陷，這與腫瘤細胞介導的免疫抑制和免疫逃逸機制密切相關。本研究擬通過培養(yǎng)人舌鱗癌細胞株Tca83細胞，探討其培養(yǎng)上清對DC的表型及功能的影響，從而尋找腫瘤本身逃避機體免疫系統(tǒng)監(jiān)視的可能機制，為提高機體抗腫瘤免疫能力的途徑提供新的理論和實驗依據。 方法：選取身體健康的志愿者15人，最小年齡23歲，最大年齡26歲，其中男8人，女7人。無菌采集取志愿者

3、外周血50ml，置入淋巴細胞分離液中，經離心分離外周血單個核細胞，吸取中間細胞層，用D-Hank's和RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞3次，棄上清，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為1×10<'7>個/ml，然后接種于6孔培養(yǎng)板，每孔3ml。5％CO<,2>、37℃條件下孵育2小時后，吸出培養(yǎng)上清，用預熱的培養(yǎng)基清洗板1次，以去除非貼壁細胞，獲得貼壁的單個核細胞(peripheral blood mononucl

4、earcell，PBMC)。將PBMC分為2組，實驗組：在體外用rhGM-CSF、rhIL-4和腫瘤上清液誘導單核細胞增殖分化成DC；對照組：即常規(guī)培養(yǎng)組，在體外用rhGM-CSF、rhIL-4誘導單核細胞增殖分化成DC，每組設3個復孔，中間適量換液并補充細胞因子。5％CO<,2>、37℃孵育5天后，對照和實驗組每孔加入TNF-a 200u/ml，7天后收集各組DC。第1、3、5、7天用倒置顯微鏡觀察DC形態(tài)；第7天每組取DC,直接免疫

5、熒光染色法染色，流式細胞分析各組DC表面分子CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達情況。各組收集DC，掃描和透射電子顯微鏡下觀察DC的形態(tài)。用ELISA法檢測兩組DC培養(yǎng)第7天上清中的IL-12的含量，通過以上方法觀察腫瘤細胞培養(yǎng)上清對樹突狀細胞的表型和功能的影響。 結果：倒置顯微鏡下，可見誘導培養(yǎng)24小時后貼壁單核細胞聚集成少量大小不等的細胞聚體，實驗組和對照組無明顯的的區(qū)別。第3天可見細胞聚集成團，實驗組

6、集落數明顯少于對照組，部分細胞體積增大。第5天，懸浮細胞數量增多，細胞表面有細小突起形成，細胞體積明顯變大，以對照組更明顯。第7天懸浮細胞有明顯樹突狀突起，以對照組更明顯，對照組細胞體積較大。培養(yǎng)第7天掃描電鏡觀察，實驗組DC表面突起較少且短，而且數量明顯少；對照組DC表面粗糙，胞體向周圍伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起。實驗組第7天透射電鏡觀察，DC細胞表面伸出少量的突起，線粒體致密化，粗面內質網擴張成池狀，溶酶體較少，有較多的空泡；

7、而對照組有較多的樹枝樣突起，空泡較少。培養(yǎng)7天后，實驗組CD80、CD83、HLA-DR的表達率較對照組低，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)，但CD86、CD1a、表達率兩組差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。實驗組DC分泌IL-12的量明顯低于對照組(23.6±5.2 pg/ml對37.2±5.8pg/ml，p<0.05)。 結論：1、舌癌Tca-83細胞培養(yǎng)上清能夠抑制樹突狀細胞分化和成熟，表現(xiàn)為DC的樹突狀突起明顯減少