1、研究背景:
　　納米ZnO優(yōu)良的光催化作用、抗菌性能、紫外線吸收能力及選擇性殺傷癌細胞的作用，使其成為倍受青睞的一種納米材料，廣泛用于電子行業(yè)、食品工業(yè)、化妝品及生物醫(yī)藥等領域。納米ZnO的廣泛應用已引起了人類對其生物安全性的關注。近年來有關納米ZnO安全性評價的研究發(fā)現:在細胞水平，納米ZnO可引起細胞代謝、應激反應、細胞信號轉導和凋亡等改變;在動物實驗中，納米ZnO通過灌胃、氣管灌注、吸入、注射等途徑進入體內后，再通過血液循環(huán)

2、到達全身各個器官，如心、肝、脾、肺、腎等，并損傷其功能。已有研究證實，口服進入體內的納米ZnO可通過胃腸靜脈系統(tǒng)吸收入肝臟并通過誘導氧化應激引起肝細胞凋亡。但是，具體的分子機制并不清楚。
　　目前，氧化應激是國內外公認的納米材料的主要損傷機制。而氧化應激是如何觸發(fā)細胞凋亡信號通路并在納米材料誘導的肝損傷中起作用的？凋亡是程序性的細胞死亡，目前已知的3條凋亡途徑包括死亡受體途徑、線粒體途徑和內質網應激途徑。內質網是真核細胞蛋白質合成

3、、翻譯后修飾、折疊和組裝的場所，也是細胞內Ca2+儲存的場所，與物質運輸、物質交換、解毒作用密切相關。肝細胞內含有大量的內質網，氧化應激、缺血再灌注損傷及各種毒物都可影響內質網的結構和功能，誘導內質網應激反應，繼而引起細胞凋亡、肝損傷等一系列級聯反應。因此我們提出這樣的假設:在納米ZnO誘導小鼠肝毒性中，ROS損傷了內質網的結構和功能，進而激活了內質網應激信號通路，引起肝細胞損傷。
　　目的:
　　確認口服納米ZnO后對小鼠

4、肝臟的亞急性及慢性損傷作用，闡明內質網應激信號通路在納米ZnO誘導的中毒性肝損傷中的作用及機制，揭示納米ZnO引起的中毒性肝損傷的發(fā)病機制，為中毒性肝損傷的防治提供新思路，并為納米ZnO的生物安全性研究提供新數據。
　　方法:
　　1.亞急性肝毒性模型:實驗用50只C57雄性小鼠（6周齡，體重20-22 g），每組10只，隨機分成納米ZnO組(100、200、400、600 mg/Kg)和生理鹽水對照組，連續(xù)灌胃14天，以建

5、立納米ZnO的亞急性肝損傷模型。檢測血清中肝功能指標ALT、AST、ALP水平;HE染色后光鏡下觀察肝臟組織病理改變;檢測肝組織勻漿氧化應激相關指標SOD、MDA; ELISA法測定肝組織勻漿凋亡蛋白Caspase3、Caspase9、Caspase12的含量;RT-PCR法檢測凋亡相關基因bcl-1、bcl-2、bax及GRP94的mRNA表達水平。
　　2.慢性肝毒性模型:實驗用50只C57雄性小鼠（6周齡，體重20-22g）

6、，每組10只，隨機分成納米ZnO組（200 mg/Kg、400 mg/Kg）、普通ZnO組(200mg/Kg、400 mg/Kg)和生理鹽水對照組，連續(xù)灌胃90天，以建立納米ZnO的慢性肝損傷模型。檢測血清中肝功能指標.ALT、AST、ALP水平;HE染色后光鏡下觀察肝臟組織病理改變;檢測肝組織勻漿氧化應激相關指標SOD、MDA、GSH;ELISA法測定肝組織勻漿凋亡蛋白Caspase3、Caspase9、Caspase12的含量;RT

7、-PCR法檢測凋亡相關基因bcl-1、bcl-2、bax及內質網應激相關基因CHOP、GRP94、 GRP78、PDI、XBP-1的mRNA表達水平;Western blot法檢測內質網應激通路蛋白PERK、p-PERK、Eif2α、p-Eif2α、JNK、p-JNK及凋亡蛋白CHOP的蛋白表達水平;透射電鏡觀察肝臟內質網形態(tài)及結構的變化;免疫組化法檢測肝組織中CHOP的表達水平。
　　結果:
　　在不同濃度納米ZnO誘導的

8、亞急性肝毒性模型中，血清肝功能指標ALT在納米ZnO組（200 mg/Kg、600mg/Kg）中明顯升高，ALP在納米ZnO組(400 mg/Kg、600mg/Kg)中明顯升高，其改變與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);肝組織病理結果變化不明顯，僅在（100 mg/Kg、200 mg/Kg）納米ZnO組中見炎癥細胞浸潤和少量點狀壞死;納米ZnO組中肝組織勻漿氧化應激指標SOD、MDA水平均明顯升高(P＜0.05)肝組織勻漿中凋亡蛋

9、白Caspase12含量在納米ZnO組(200、400、600 mg/Kg)中均明顯升高(P＜0.01)，Caspase9含量在納米ZnO組（600 mg/Kg）中明顯升高(P＜0.05);抗凋亡基因bcl-1、bcl-2在納米ZnO組表達水平明顯降低，而促凋亡基因bax及內質網分子伴侶基因GRP94表達水平上調，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　在納米ZnO誘導的慢性肝損傷模型中，血清肝功能指標ALT、AST在納米Zn

10、O組（200 mg/Kg、400 mg/Kg）中均明顯升高，其改變與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);肝組織病理結果顯示，在納米ZnO組可見灶狀壞死及中央靜脈擴張淤血;納米ZnO組中氧化應激水平明顯升高，表現為:與對照組比較，其GSH水平明顯降低;而MDA、SOD水平明顯升高，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);納米ZnO組中Caspase3、Caspase9、Caspase12的含量與對照組比較均明顯升高，其差異有統(tǒng)計學意義(P

11、＜0.05);納米ZnO組抗凋亡基因bcl-1、bcl-2基因表達水平明顯低于對照組，且促凋亡基因bax、CHOP基因表達水平明顯高于對照組，其差異具有統(tǒng)計學意義;納米ZnO組內質網應激相關基因GRP94、GRP78、PDI、XBP-1表達水平明顯高于對照組，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);Western blot檢測結果發(fā)現納米ZnO組p-Eif2α、p-JNK、p-PERK、CHOP蛋白表達水平均高于對照組;電鏡觀察內質網結構

12、及形態(tài)發(fā)現納米ZnO組的內質網腫脹，核糖體脫顆粒明顯，對照組內質網結構正常;免疫組化結果表明，納米ZnO組的CHOP表達水平明顯高于對照組及普通ZnO組。
　　結論:
　　本實驗條件下，反復灌胃不同濃度(100、200、400、600 mg/Kg)的納米ZnO造成的小鼠亞急性肝毒性，主要是通過氧化應激機制介導，其損傷程度與納米ZnO的灌胃濃度無明顯劑量效應關系。納米ZnO灌胃小鼠的慢性肝毒性模型證實，納米ZnO灌胃小鼠后誘導