1、目的:建立分子信標熒光定量PCR快速檢測結(jié)核桿菌方法，為臨床結(jié)核病的診斷提供特異性強、靈敏度高、可標準化、自動化的檢測方法；評價分子信標熒光定量PCR法在檢測臨床標本中的應用價值；評估分子信標熒光定量PCR法用于監(jiān)控抗結(jié)核治療的可行性：應用所建立方法開發(fā)檢測試劑盒。 方法: 1．分子信標與引物的設(shè)計與合成查閱文獻，選擇適合結(jié)核分枝桿菌復合群檢測的靶基因。在GenBank數(shù)據(jù)庫中查詢靶基因序列，找出高度保守的區(qū)段。遵循分子

2、信標與引物設(shè)計的規(guī)則，設(shè)計探針與引物并提交公司合成。對新合成的探針與引物進行篩選與反應性確認。選擇結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的最佳提取方法。 2．分子信標檢測結(jié)核分枝桿菌方法的建立與評價 1)分別優(yōu)化熒光定量PCR反應的退火溫度、Mg<'2+>濃度、Taq DNA聚合酶用量、PCR Buffer濃度、循環(huán)參數(shù)等條件，建立熒光定量PCR方法。 2)方法評價 特異性：用已建立方法分別檢測10株標準菌株與150株

3、臨床分離結(jié)核分枝桿菌。 靈敏度：以結(jié)核分枝桿菌H37Ra為試驗菌株，對模板DNA 10倍梯度稀釋，分析方法的最低檢出拷貝數(shù)。 抗干擾性：接種2支菌量相當(約10<'5>cfu)的結(jié)核分枝桿菌，其中一支加入菌量遠大于結(jié)核分枝桿菌的其他雜菌，提取模板DNA分別用已建立方法檢測。 重復性：用已建立方法重復3次測定同一濃度的模板DNA。 3．分子信標檢測結(jié)核分枝桿菌方法的應用與產(chǎn)品開發(fā) 評估采集臨床疑似結(jié)