1、根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2004年公布的資料顯示在過去10年間全球癌癥的發(fā)病率及死亡率增長了22％，其中肝癌無論從發(fā)病率還是死亡率來看，均為全球對人類身體健康危害最大的癌癥之一。尤其在東亞和非洲。在我國，肝癌是發(fā)病率僅次于胃癌的高發(fā)癌癥。肝癌和其它腫瘤一樣是遺傳和環(huán)境等諸多因素的相互作用所致，涉及大量相關基因的結構和表達調控的改變。因此克隆，篩選和鑒定與肝癌相關的基因仍然是肝癌分子生物學研究領域的一個前沿和重點研究課題。 尋找

2、肝癌相關基因的首要步驟之一是得到在肝癌組織中異常表達的基因。我們實驗室運用cDNA芯片的方法獲得了一批在肝癌中異常表達的已知和未知基因。對這些基因的進一步功能研究將有助于對肝癌發(fā)病分子機理的深入了解。我們首先挑選了15個在芯片結果顯示有差異表達的基因，并擴大組織樣本，運用半定量RT-PCR方法做進一步驗證。得到了2個較有意義的基因：KIAA0101和DLKl。本課題對這兩個基因與肝癌的相關性進行較深入的研究。 KIAA0101，

3、cDNA全長888bp，編碼111個氨基酸，已經有報導在甲狀腺癌，結腸癌和非小細胞肺癌中在mRNA水平上有異常表達，但在肝癌中尚無表達狀態(tài)的報導。先前的cDNA芯片結果提示KIAA0101在肝癌組織中表達較高，進一步運用半定量RT-PCR方法顯示在8／15對樣本中，癌組織表達高于相應的癌旁肝組織。利用原核表達系統(tǒng)表達了KIAA0101的蛋白并制備多克隆兔抗體，Westernblot結果顯示在25／30對組織標本中肝癌組織中蛋白表達比相應

4、的癌旁肝組織低，與mRNA的表達情況相反。組織芯片免疫組化結果顯示，在107／161例肝癌組織中，KIAA0101表達為弱陽性(+)或陰性(一)；而在相應的癌旁肝組織中，僅有24／161例為弱陽性(+)或陰性(一)，統(tǒng)計學上有顯著差異(P<0．05)。我們的結果顯示KIAA0101mRNA和蛋白表達水平在肝癌組織中的表達呈負相關性。生物信息學提示KIAAOl01蛋白定位于細胞內的線粒體，雙重免疫熒光的方法顯示KIAA0101可與線粒體內

5、膜蛋白的熒光圖像大部分重疊，表明蛋白大部分定位于線粒體內，同時少數(shù)位于核內。利用線粒體特異性抗體從細胞總蛋白內富集細胞內線粒體蛋白，運用Westernblot方法也得到了相似的結果。將KIAA0101組建表達載體并轉染肝癌細胞后，應用pMACSmmII磁珠分選系統(tǒng)將KIAA0101瞬時高表達的細胞分離。體外生長曲線表明KIAAOi01對細胞的生長有抑制作用(P<0．05)；流式細胞儀分析結果顯示KIAAOi01高表達陽性細胞的S期比例為

6、21．35％±1．28，而相應的對照細胞S期比例為29．45％+1．45，具有統(tǒng)計學意義(P

7、)是一個跨膜蛋白，由383氨基酸組成，胞外有6個EGF結構域，1個跨膜結構域和1個胞內區(qū)。它與notch-1的配體delta有較高的同源性，但因它不具有與notch-1相結合所必需的DZL結構域，故推測它們互相之間不能結合。DLKl與脂肪細胞的形成密切相關，高表達時能夠抑制脂肪細胞的生成。DLKl是一個父系表達的印跡基因。已經證明DLKl可以增加某些未分化神經腫瘤的惡性程度，在神經母細胞瘤、小細胞肺癌、神經內分泌腫瘤、腦瘤和血液病中高表

8、達。另外它在血液和肝臟的祖細胞中高表達，已經成為祖細胞的標志之一。在小鼠的實驗中，RT-PCR方法證明DLKl在胚胎肝組織中高表達而在成體肝組織不表達。在鼠胚胎肝中利用DLKl的抗體可以分離出成肝細胞；體外培養(yǎng)實驗中，分離得到的DLK1+肝細胞增值活性高于DLKI'肝細胞。因此我們選擇DLKl作進一步研究。半定量RT-PCR(5／M)，Northernblot(4／12)和Westernblot(6／17)結果中顯示DLKl在部分肝癌組

9、織中的mRNA和蛋白表達均高于相應的癌旁肝組織。4例肝癌細胞株中，一株高表達(Hep3B)而另外三株(SMMC7721，7402和HepG2)沒有檢測到表達。在SMMC772l細胞株轉染篩選獲得了高表達DLKl的穩(wěn)定細胞株，同時運用腺病毒包裝系統(tǒng)構建出含有DLKl的病毒。體外試驗中，穩(wěn)定表達DLKl的SMMC7721克隆株和利用腺病毒瞬時感染高表達的DLKl的SMMC772l細胞均比對照細胞生長較快(P<0．05)。裸鼠體內成瘤試驗也表

10、明穩(wěn)定高表達DLKl對SMMC7721肝癌細胞的生長起促進作用。利用nocodazol阻滯細胞于G2／M期后，在不同的間隔時間作細胞周期分析。結果顯示DLKl能夠使細胞較快地從G2／M期過渡到S期(實驗組為16小時，而對照組為21小時)。在信號轉導通路中，發(fā)現(xiàn)DLKl高表達的細胞中，細胞周期相關基因p34cdc2的蛋白表達雖然沒有變化，但15位酪氨酸的磷酸化狀態(tài)降低。已經有報導p34cdc2蛋白的15位酪氨酸的低磷酸化可以導致蛋白活性的

11、增加從而加快細胞周期循環(huán)。我們進行的p34cdc2蛋白體外激酶活性試驗中顯示，在DLKl高表達的細胞株中p34cdc2的激酶活性升高。在肝癌組織標本中，雙重免疫熒光顯示DLKl高表達的肝癌細胞中，AFP表達也較強，二者有明顯的相關性。提示DLKl高表達的肝癌細胞處于低分化狀態(tài)，而其增值能力比較強。綜上所述，DLKl在部分肝癌組織中處于高表達的狀態(tài)；在低表達的肝癌細胞株SMMC7721轉染DLKl后，體內外實驗結果表明可以促使腫瘤細胞生長