1、目前以腫瘤免疫治療為代表的腫瘤生物治療已經成為繼手術、化療和放療之后的第四種腫瘤治療模式，研究和開發(fā)新型腫瘤疫苗已經成為近年國際上腫瘤免疫治療的熱點之一。在目前已知的眾多腫瘤相關抗原中，癌睪丸抗原（CTA）有其特異的表達模式，即在各種腫瘤組織中有不同頻率的表達，而在正常組織中僅在睪丸生殖細胞中表達，偶然在胎盤中表達。但睪丸是免疫豁免器官，不引起機體特異性免疫反應。因此，CTA適于作為特異性腫瘤免疫治療的靶抗原。
　　 作為CTA

2、亞家族的黑色素瘤抗原基因（MAGE）是從黑色素瘤細胞中分離出來的一大家族抗原基因，其編碼的腫瘤排斥抗原在細胞內經加工產生抗原肽，并與HLA-Ⅰ類分子結合形成復合物，能夠被自體細胞毒性T細胞識別，誘導出對相應腫瘤細胞的特異性殺傷。MAGE基因在許多腫瘤組織中有較高的表達，但在正常組織（除睪丸和胚胎外）均不表達，因此可作為CTL介導腫瘤特異性免疫治療的理想靶分子。深入研究MAGE基因的功能將會為開展腫瘤分子學診斷和腫瘤免疫治療的臨床應用奠定

3、良好的基礎。
　　 有研究提示，MAGE-A4可能表現了與該家族中其它成員不同的分子生物學特性，但是其具體的生物學功能和分子機制到目前還不十分清楚。本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測了MAGE-A4 mRNA在77例乳腺癌良惡性組織及乳腺癌細胞系中的表達；構建了同時表達MAGE-A4和FLAG標簽的表達載體FLAG-pcDNA3-MAGE-A4，并通過MTT分析和克隆形成實驗研究了MAGE-A4過表達對MAGE-A

4、4低表達的乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響；采用熒光素酶報告基因分析、RT-PCR、Western-blot、克隆形成實驗和TUNEL染色法檢測了MAGE-A4對p53轉錄活性的影響；采用細胞質與細胞核分離實驗檢測了MAGE-A4在細胞中的定位；采用免疫熒光染色技術檢測了MAGE-A4與p73蛋白在細胞中的共定位；采用免疫共沉淀技術檢測了MAGE-A4與p53家族成員之間的物理性結合；利用siRNA技術研究了抑制MAGE-A4基因對高表達MA

5、GE-A4的乳腺癌細胞系凋亡的影響。主要研究內容和結果如下：
　　 第一部分：腫瘤抗原MAGE-A4在乳腺癌組織和細胞系中的表達
　　 目的：通過檢測MAGE-A4在乳腺正常組織、癌旁組織和癌組織及六種乳腺癌細胞系中的表達，探討其表達與乳腺癌臨床指標及生物學行為的關系
　　 方法：采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術從轉錄水平上檢測MAGE-A4在乳腺正常組織、癌旁組織和癌組織及六種乳腺癌細胞系中的表達，并

6、回顧性分析其表達與乳腺癌臨床指標與生物學行為（包括患者年齡、腫瘤大小、TNM分期、病理類型、組織學分級、腋淋巴結轉移狀況、有否脈管瘤栓、ER/PR和HER-2表達）的關系。
　　 結論：
　　 1.正常乳腺組織中無MAGE-A4 mRNA表達；乳腺癌旁組織中MAGE-A4 mRNA表達陽性率為5.19％；乳腺癌組織中MAGE-A4 mRNA表達陽性率為42.9％。提示MAGE-A4可作為腫瘤特異性抗原。
　　 2

7、.MAGE-A4 mRNA表達與乳腺癌患者的腫瘤大小、臨床分期、病理類型、組織學分級、淋巴結轉移、脈管瘤栓、ER/PR及HER-2狀態(tài)無明顯相關性,但與患者的年齡存在明顯的相關性。60歲以上乳腺癌患者腫瘤組織中MAGE-A4mRNA表達陽性率明顯高于60歲以下乳腺癌患者。
　　 3.六種乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB-453和MDA-MB-468中均無MAGE-A4 mRNA表達

8、；MDA-MB-436中MAGE-A4 mRNA呈高表達。
　　 第二部分：FLAG-pcDNA3-MAGE-A4表達載體的構建及功能分析
　　 目的：構建帶有FLAG標簽的MAGE-A4基因表達載體，并研究其對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法：利用巢式PCR及基因重組技術構建帶有FLAG標簽的MAGE-A4基因表達載體FLAG-pcDNA3-MAGE-A4，并通過克隆形成實驗和MTT法研究MAGE-A4

9、過表達對MAGE-A4低表達的乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響。
　　 結論：
　　 1.成功構建了MAGE-A4基因表達載體FLAG-pcDNA3-MAGE-A4，并且構建好的載體在體外表達陽性。
　　 2.外源性MAGE-A4可以抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞的增殖。
　　 3.外源性MAGE-A4增加了阿霉素誘導的MCF-7細胞的死亡率；但對MDA-MB-231細胞沒有顯著影響。
　　

10、第三部分：MAGE-A4與p53家族之間關系的研究
　　 目的：研究MAGE-A4對p53轉錄活性的影響，MAGE-A4是否與p53家族成員之間存在直接的物理結合，進而證實MAGE-A4的功能發(fā)揮是否部分或全部通過p53通路而完成。
　　 方法：采用熒光素酶報告基因分析、RT-PCR、Western-blot、克隆形成實驗和TUNEL染色法檢測MAGE-A4對p53轉錄活性的影響；采用細胞質與細胞核分離實驗檢測MAGE-

11、A4在細胞中的定位；采用免疫熒光染色技術檢測MAGE-A4與p73蛋白在細胞中的共定位；采用免疫共沉淀技術檢測MAGE-A4與p53家族成員之間的物理性結合。
　　 結論：
　　 1.MAGE-A4可以增加p53的轉錄活性。
　　 2.MAGE-A4可以通過增加p53轉錄活性而產生抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的功能。
　　 3.MAGE-A4在細胞質和細胞核中均有表達。
　　 4.p73和MAGE-

12、A4在細胞核中存在共定位。
　　 5.p53和MAGE-A4蛋白之間以及p73和MAGE-A4蛋白之間均存在物理性結合。MAGE-A4蛋白通過和p53家族成員之間的直接結合而發(fā)揮生物學功能。
　　 第四部分：MAGE-A4siRNA對乳腺癌細胞MDA-MB-436凋亡的影響
　　 目的：檢測靶向MAGE-A4 siRNA對乳腺癌細胞MDA-MB-436凋亡的影響。
　　 方法：采用MAGE-A4 siRN

13、A轉染抑制乳腺癌細胞MDA-MB-436中MAGE-A4的表達，然后使用順鉑誘導細胞凋亡，利用TUNEL染色法、流式細胞分析技術及檢測PARP蛋白裂解來分析MAGE-A4 siRNA對乳腺癌細胞MDA-MB-436凋亡的影響。
　　 結論：
　　 1.靶向MAGE-A4 siRNA轉染對MDA-MB-436細胞MAGE-A4表達有明顯的抑制效果。
　　 2.MDA-MB-436對阿霉素耐藥，而對順鉑較敏感。