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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究野生型和polyQ擴(kuò)展突變型ataxin-3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位及ataxin-3蛋白的polyQ擴(kuò)展突變對(duì)線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的影響,以期更深入地了解ataxin-3的生物學(xué)功能及突變型ataxin-3蛋白的可能毒性作用機(jī)制。
方法:用Lipofectamine2000脂質(zhì)體將GFP-ataxin-3融合蛋白表達(dá)載體pEGFP-N1-MJD20Q/68Q轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后采用間
2、接免疫熒光法用紅色熒光染料分別標(biāo)記識(shí)別線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的標(biāo)記蛋白TOM20、GM130、calnexin。在激光共聚焦顯微鏡下觀察ataxin-3蛋白是否與各細(xì)胞器共定位及ataxin-3蛋白的polyQ擴(kuò)展突變對(duì)線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的影響。
結(jié)果:
1.ataxin-3蛋白與線粒體標(biāo)記蛋白TOM20無(wú)共定位,但表達(dá)polyQ擴(kuò)展型ataxin-3組線粒體碎裂細(xì)胞百分比增加(P<0.05)。
3、 2.ataxin-3蛋白與高爾基體標(biāo)記蛋白GM130無(wú)共定位信號(hào)且擴(kuò)展突變型ataxin-3也不引起高爾基體碎裂。
3.野生型和polyQ擴(kuò)展型ataxin-3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白calnexin均有部分共定位;擴(kuò)展突變型ataxin-3與calnexin重疊信號(hào)較多,且重疊信號(hào)大多位于聚集體所在處。
結(jié)論:
1.polyQ擴(kuò)展型ataxin-3蛋白可能間接損害線粒體完整性參與SCA3/MJD致病。
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