1、基因芯片,又稱DNA微陣列,是由固定于固相載體表面的核苷酸探針陣列所構成的一種新型微型器件.它基于核酸分子雜交的原理,可直接、平行的得到大量的核酸序列信息.基因芯片以其高通量、高信息量、且自動化程度高的特點成為檢測基因突變的最佳方法之一.肥厚型心肌病(HCM)是一種以心肌非對稱性肥厚為特征的原發(fā)性心肌病,是遺傳異質性疾病,屬常染色體顯性遺傳,約55％以上的患者有家族史.HCM是一種常見的心肌病,會使健康青年猝死,是危害人類健康的主要疾病

2、之一.該課題針對心肌肌鈣蛋白I(Cardiac troponin I,cTnI)基因上4個外顯子的突變進行了一系列基于基因芯片原理和技術的系統(tǒng)實驗研究,這四個外顯子的突變與家族性肥厚型心肌病(Family Hypertrophic Cardiomyopathy,FHCM)的發(fā)生密切相關.最終目的旨在開發(fā)高靈敏度、高特異性的家族性肥厚型心肌病相關cTnI基因突變檢測芯片.為此,該文對有關基因芯片的制作進行了初步的研究,并制備了cTnI基因

3、突變檢測芯片,取得了較為滿意的結果.我們首先參照文獻設計了能特異擴增靶序列的引物,并對從新鮮血液中提取出的DNA進行PCR擴增,摸索并優(yōu)化了PCR擴增的反應體系與退火溫度、循環(huán)次數(shù)等擴增條件.為了使操作簡化,隨后我們探索了多重PCR擴增技術,實現(xiàn)了對該基因上4條外顯子的二重或三重PCR擴增.實驗結果表明:Mg<'2+>離子濃度對多重擴增效果影響很大,較低的Mg<'2+>濃度有利于提高特異性.此外,在相同條件下,適當高的退火溫度可以增加擴

4、增的特異性,在我們的實驗體系中,退火溫度為64℃時擴增的特異性最佳.為了制作基因芯片,我們針對外顯子上的突變特征設計了特異性探針,制備了可以同時對cTnI基因上四條外顯子的突變進行檢測的集成式芯片.并通過與擴增得到的靶序列進行雜交,系統(tǒng)摸索并優(yōu)化了雜交溫度、雜交時間等雜交條件對雜交結果的影響,取得了較好的特異性雜交/非特異雜交信號強度比.將該芯片應用于遺傳性肥厚性心肌病相關基因突變的分析,結果表明,該芯片檢測突變正錯配區(qū)別明顯(正中堿基