1、腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高，是嚴重危害人類健康的重大疾病之一。其中，缺血性腦血管病的發(fā)病在臨床更為多見，盡早的恢復腦血流和盡可能的逆轉受損的神經(jīng)細胞，是目前治療的重點。然而若不能及時恢復血流，則會引起腦缺血再灌注損傷，使病情加重。近來研究發(fā)現(xiàn)，腦血流中斷和血液再通使腦的組織、細胞產(chǎn)生損傷是一個動態(tài)、快速發(fā)展的級聯(lián)反應。這個損傷級聯(lián)反應包括興奮性氨基酸毒性、能量代謝障礙、細胞內鈣超載、炎癥反應等多種病理機

2、制。 本研究選用在體大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷和離體培養(yǎng)神經(jīng)元缺氧/復氧損傷兩種模型，從整體和細胞水平入手，以神經(jīng)細胞凋亡和壞死的時空變化為切入點，動態(tài)觀察腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷過程的時空變化規(guī)律；選用臨床有效藥物心腦舒通膠囊對腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷進行干預，觀察氧自由基、炎性因子、細胞骨架、細胞內鈣和凋亡調控因子等指標變化，結合形態(tài)學了解腦組織病理改變，探討心腦舒通膠囊對腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷的保護作用以及其可能的作用環(huán)節(jié)。與

3、此同時，聯(lián)系中醫(yī)“毒損腦絡”假說，進一步從腦缺血再灌注損傷的病理生理過程和心腦舒通膠囊保護作用機制兩方面，為中醫(yī)“毒損腦絡”假說提供現(xiàn)代科學依據(jù)，豐富和完善腦缺血的中醫(yī)基礎理論。 實驗包括以下三部分： 第一部分：大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織形態(tài)學與細胞凋亡時空變化規(guī)律的研究 目的：探討腦缺血1.5小時后再灌注不同時間，大鼠腦組織不同部位的病理損傷與神經(jīng)細胞凋亡的動態(tài)變化。 方法：采用線栓法致大鼠大腦中動脈

4、阻塞建立局灶性腦缺血再灌注模型。隨機分為：假手術組，腦缺血1.5h后再灌注3h、6h、12h、24h、48h、72h各組，共7組。HE染色和尼氏染色觀察腦組織形態(tài)學變化和損傷狀況；透射電鏡觀察神經(jīng)細胞超微結構改變；TUNEL法測定腦缺血損傷區(qū)神經(jīng)細胞凋亡的表達。 結果：腦缺血1.5h再灌注不同時間，大鼠腦組織內出現(xiàn)不同程度的病理損傷和神經(jīng)細胞凋亡，形態(tài)學上觀察損傷部位以大腦皮層和尾殼核多見。HE染色和尼氏染色發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細胞間隙增

5、寬，水腫明顯，有核固縮等現(xiàn)象；透射電鏡亦發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元水腫，可見凋亡小體。腦組織病理損傷趨勢在再灌注12h～48h內最為顯著。TUNEL結果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡以再灌注12h～48h時較明顯，再灌注24h時凋亡達最高峰。其中皮層損傷范圍較廣，細胞凋亡較多。 第二部分：心腦舒通膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究 目的：從腦缺血再灌注損傷后氧自由基、炎性因子、細胞骨架、凋亡調控因子等幾 個方面的變化著手，結合形態(tài)

6、學了解腦組織病理改變，研究心腦舒通膠囊對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其可能的作用機制。 方法：采用線栓法致大鼠大腦中動脈阻塞建立局灶性腦缺血再灌注模型。隨機分為3組：假手術組，腦缺血1.5h后再灌注24h模型組，心腦舒通膠囊治療組。HE染色和尼氏染色觀察大腦皮層區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學變化；透射電鏡觀察神經(jīng)細胞超微結構改變；TUNEL法測定皮層區(qū)神經(jīng)細胞凋亡的表達；生化法檢測患側大腦組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸(

7、LD)和乳酸脫氫酶(LDH)的活力和含量；ELISA法和放射免疫競爭法測定患側大腦組織和血清中IL-1β與TNF-α的含量；免疫組織化學法測定大腦皮層中MAP-2、β-tublin、Bax、Bcl-2、Fas、Fas-L與Caspase-3蛋白的表達；RT-PCR法測定大腦皮層內Caspase-3基因的表達。 結果： (1) 腦缺血1.5h再灌注24h大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，腦組織有明顯的缺血形態(tài)學改變如神經(jīng)元水

8、腫、核固縮等現(xiàn)象。 (2) 心腦舒通膠囊可以升高缺血側大腦組織中SOD活力，降低MDA含量；降低LD含量和LDH活力。 (3) 心腦舒通膠囊可以減少血清TNF-α和IL-1β含量和缺血側大腦組織中TNF-α和IL-1β蛋白表達。 (4) 心腦舒通膠囊能夠增加缺血側大腦皮層內MAP-2和β-tublin蛋白表達； (5) 心腦舒通膠囊明顯降低缺血側大腦皮層內BaxN白表達，增加皮層內Bcl-2蛋白表達和Bc

9、l-2/Bax比值；減少皮層內Fas和Fas-L蛋白表達，降低皮層內Caspase-3蛋白和基因表達，顯著減少凋亡的神經(jīng)細胞數(shù)量。 第三部分：蒺藜皂苷對皮層神經(jīng)元凋亡的保護作用及機制研究 目的：從細胞內鈣、線粒體膜電位、Caspase-3/7活性入手，觀察蒺藜皂苷對大鼠皮層神經(jīng)元經(jīng)缺氧/復氧后細胞凋亡的影響，并探討其可能的作用環(huán)節(jié)。 方法：原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，先用95％N<,2>與5％CO<,2>混合氣體造成

10、細胞缺氧3小時，再給予95％O<,2>與5％CO<,2>混和氣進行復氧，建立缺氧/復氧誘導的皮層神經(jīng)元凋亡模型。中藥組于缺氧和復氧時分別加入不同濃度的蒺藜皂苷進行干預。MTT法觀察蒺藜皂苷對皮層神經(jīng)元活力的影響，比色法測定細胞乳酸脫氫酶釋放漏出率；AO熒光染色和Annexin V-FITC*/PI雙染共同分析凋亡的神經(jīng)元形態(tài)和凋亡率；Fluo-3熒光染色，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞內鈣平均熒光值變化；JC-1熒光染色，激光掃描共聚焦顯

11、微鏡觀察細胞線粒體膜電位的變化，熒光酶標儀檢測神經(jīng)元胞漿Caspase-3/7的活性，并采用免疫細胞化學法觀察細胞Bax蛋白表達的情況。 結果：皮層神經(jīng)元經(jīng)缺氧3h復氧不同時間可造成細胞損傷，其中缺氧3h復氧12h誘導的神經(jīng)元損傷較為嚴重，以凋亡為主。蒺藜皂昔可增加皮層神經(jīng)元活力，降低乳酸脫氫酶漏出率和細胞內鈣，增加細胞線粒體膜電位水平，抑制Caspase-3/7的活性，并降低Bax蛋白的表達，降低缺氧/復氧誘導的皮層神經(jīng)元的凋

12、亡。 結論： 局灶性腦缺血后再灌注不同時間可以誘發(fā)不同程度的腦組織損傷和細胞凋亡，損傷部位以大腦皮層和尾殼核多見，皮層損傷范圍較廣，損傷的嚴重程度和細胞凋亡的表達多集中于再灌注24h，所以此時間點的腦缺血再灌注模型可以用來進行藥物的干預研究。心腦舒通膠囊可以通過降低氧自由基損傷、炎性因子表達，維持細胞骨架的結構完整性，減少細胞內鈣超載，維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，調節(jié)各種凋亡調控因子的表達，最終達到減少神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，保

13、護受損的腦組織。我們認為，腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程和終結果與中醫(yī)“內毒損傷腦絡”的假說相符合，過多的氧自由基和代謝物質、炎性因子和細胞內鈣即相當于“內毒”，腦組織結構損傷和神經(jīng)細胞凋亡即相當于內毒損傷腦絡的最終結果。內毒損傷腦絡，其毒邪產(chǎn)生源于內生諸邪，形成火毒、痰毒、瘀毒等，因此祛除內生之毒，當現(xiàn)解除生毒之邪，心腦舒通膠囊通過活血通絡，及時活血化瘀，可在一定程度上減緩腦梗死“瘀毒”的損害作用，全面地改善受損的腦組織，從而起到神經(jīng)