1、目的：
　　丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是全球性公共衛(wèi)生問題，目前全世界感染人數約1.7億，其中85％將發(fā)展成為慢性丙型肝炎?，F有的抗HCV唯一標準治療方案是聚乙二醇干擾素聯合利巴韋林，但該療法對病毒基因型有很強的依賴性，2、3型感染者獲得持續(xù)病毒學應答(sustained virological response，SVR)率為70％～90％，而1、4型感染者僅為40％～60％。缺乏高效的體外細胞

2、復制體系和小動物模型是阻礙HCV致病機制研究及抗病毒藥物研發(fā)的主要原因。1999年Lohmann等建立的選擇性雙順反子亞基因組HCV RNA復制子系統(tǒng)標志著HCV體外培養(yǎng)技術的一大進步，為HCV的基礎研究和藥物篩選提供了一個新的平臺。該亞基因組復制子將編碼結構蛋白的基因刪除，用2個異源性成分取而代之，其一為選擇性標志物新霉素磷酸轉移酶(neo)基因，其二為腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)的內

3、部核糖體進入位點(internal ribosome entry site IRES)。上游順反子在HCV IRES作用下啟動新霉素磷酸轉移酶基因表達，下游順反子在EMCV IRES作用下啟動HCV NS3～5B蛋白質的翻譯。通過轉染Huh-7細胞和G418篩選，獲得的選擇性HCV RNA復制子雖能在Huh-7細胞中穩(wěn)定高效地自主復制，但需細胞培養(yǎng)適應性突變，且轉染效率極低。由于結構基因的刪除，HCV亞基因組復制子不能產生完整的病毒顆粒

4、，無法用于HCV生活周期、病毒組裝釋放及HCV結構蛋白的研究。之后研究者用HCV全長基因組替換亞基因組復制子的NS3～5B，構建了HCV全基因組復制子。同亞基因組復制子一樣，全基因組復制子也需進行體外適應性突變后才能獲得高效的復制能力，且同樣無法產生感染性病毒顆粒，不能完全代表HCV在體內的復制過程。2005年JFH-1體外細胞培養(yǎng)體系的建立成為HCV發(fā)展史上的里程碑。JFH-1系從日本1例暴發(fā)性丙型肝炎患者體內分離獲得，其基因型為HC

5、V2a型，是迄今唯一無需適應性突變即能在體外高效復制并產生感染性病毒顆粒的毒株。然而，HCV是一具有高度異質性的病毒，JFH-1與其他基因型病毒株在生物學性狀、臨床特征及治療效果等方面均有很大差異，無法代表所有HCV的特性。因此，建立能產生完整病毒顆粒的HCV各基因型細胞培養(yǎng)模型是當前HCV研究的重要任務。
　　獲取HCV全長基因組序列是構建HCV體外細胞培養(yǎng)模型的基礎。目前國內外雖已構建了大量的HCV全基因組克隆，但均是通過短片

6、段擴增、拼接而成。由于HCV存在極其復雜的準種特性，這種多片段拼接易造成不同變異株間的錯誤連接，得到的只是人工重組體，而不是患者體內真實存在的病毒基因組。采用長鏈RT-nested-PCR方法一次性擴增出HCV基因組全長片段可以完全避免上述問題，但難度很大，國內外均未獲成功。HCV基因組具有復雜的二級結構、鳥嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine，GC)含量高、血清HCV RNA濃度低、難以通過逆轉錄獲得長9.6kb的完

7、整cDNA模板等都是導致HCV全基因組擴增失敗的原因。目前報道的從患者血清一次性擴增出的HCV基因組最長片段為9.1kb，其擴增片段未包含病毒基因組包裝和復制所必須的結構3’UTR，無法用于體外細胞培養(yǎng)模型的建立。
　　針對上述問題，本課題通過對HCV全基因組長鏈RT-nested-PCR擴增方案的不斷摸索、優(yōu)化，旨在一次性擴增出包括5’、3’UTR在內的HCV基因組全長，構建真實可靠的HCV全基因組克隆，為進一步構建HCV體外細

8、胞培養(yǎng)模型奠定基礎。
　　本研究分為三個部分：第一部分以pJFH-1質粒為模板，通過優(yōu)化長鏈PCR反應體系及條件，建立適用于HCV全基因組擴增的長鏈PCR方案；第二部分在第一部分的基礎上，改進HCV長鏈RT及nested-PCR方案，建立從血清一次性擴增HCV基因組全長的長鏈RT-nested-PCR方法，并構建HCV全長基因組克隆，為建立中國人HCV體外復制子模型奠定基礎；第三部分對所克隆HCV全基因組序列進行基因分型、進化分析

9、，并對其復制能力進行了初步預測，為下一步構建HCV體外細胞復制模型提供理論依據。
　　材料和方法：
　　1．HCV長鏈PCR方法的建立和優(yōu)化：以pJFH-1質粒為測試模板，通過長鏈PCR引物的篩選、PCR DNA聚合酶的比較、甘油或/和DMSO最適濃度的篩選、循環(huán)條件的摸索等，建立能穩(wěn)定擴增HCV全基因組的長鏈PCR方案。
　　2．HCV長鏈RT-nested-PCR方法的建立和優(yōu)化：以GenBank中所有HCV全長序

10、列為參考，在Poly(U/UC)區(qū)后選擇相對保守、GC含量適宜的區(qū)域進行長鏈RT及nested-PCR引物的設計。由于HCV全長約9.6kb，獲得完整cDNA難度很大，因此在5’UTR和NS5B區(qū)各設計了一對PCR引物用于驗證cDNA完整性。通過長鏈RT及nested-PCR引物的篩選、多種RNA提取方法的比較、RT反應體系及條件的優(yōu)化、長鏈nested-PCR方案的優(yōu)化，建立HCV全長RT-nested-PCR擴增方案。
　　3

11、．HCV全基因組克隆的構建：將獲得的HCV全基因組片段通過膠回收純化、TA克隆、轉化TOP10感受態(tài)細胞獲得HCV全長基因組克隆并驗證。
　　4．HCV全長序列的分析：通過對測序結果處理、拼接獲得HCV全長序列。繪制系統(tǒng)進化樹進行同源性分析，并對其復制能力進行初步預測，為下一步構建HCV體外細胞復制模型提供理論依據。
　　結果：
　　1．建立了HCV全基因組長鏈RT-nested-PCR擴增方案：設計的長鏈RT引物(R

12、TP-1)及nested-PCR引物(外側引物對ESP-1、EAP-1；內側引物對ISP-1、IAP-1)能穩(wěn)定擴增出HCV基因組全長；采用Qiagen公司的QIAamp viral RNA mini kit提取可得到完整的RNA模板；RT反應選用invitrogen公司的SuperScript III，用優(yōu)化的RT條件進行逆轉錄反應可獲得完整的cDNA。長鏈nested-PCR選用invitrogen公司的Platinum Taq D

13、NA Polymerase High Fidelity，反應條件為94℃2min；94℃15sec、68℃9.5min，15個循環(huán)；94℃15sec、68℃9.5min+10sec/cycle，20個循環(huán)；然后68℃10min可成功實現HCV全長的擴增。
　　2．構建了HCV全基因組克?。簩CV全長PCR產物經TA克隆獲得了6個HCV全基因組克隆(命名為CQFL1～6)，并經質粒直接電泳分析及內側引物對(ISP-1、IAP-1)

14、擴增HCV全長驗證，提示HCV全長基因組克隆構建成功。
　　3．序列分析得知所克隆HCV基因組為HCV1b型，與新加坡1b株(accession no. AF356827)親緣性最近。通過NS5B區(qū)氨基酸序列分析發(fā)現：相對于其他HCV1b株而言，有4個位點氨基酸為CQFL1～6所特有，分別為250K、424V、435V、564V，其中后3個位點的氨基酸與JFH-1相應位點氨基酸一致。推測CQFL1～6 NS5B的空間結構可能較其他