1、研究背景：先天性巨結腸癥(Hirschsprung'sdisease，簡稱HD)，又稱腸無神經(jīng)節(jié)細胞癥，發(fā)病率為1/5000，在胃腸道先天性畸形疾病中占第二位，男女發(fā)病比例約4∶1。臨床上表現(xiàn)為完全性或不完全性腸梗阻癥狀，嚴重影響小兒的生活質(zhì)量，甚至危及生命。HD主要發(fā)病原因是腸壁肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)細胞缺失，以致受累腸段異常收縮，其近端結腸代償性擴張肥厚，形成巨結腸。近年來，HD發(fā)病率有所上升，引起國內(nèi)外學者的重視。HD是一種病因復雜的

2、疾病，雖然HD的病理學基礎為病變腸段神經(jīng)元細胞缺失，但神經(jīng)元細胞缺失的原因至今仍有爭議。所以進一步明確HD的發(fā)病機理，降低HD的發(fā)病率，并探索有效的非創(chuàng)傷性治療方法，成為目前最為關注的問題。 HD的發(fā)病與多種因素有關，包括基因遺傳因素和微環(huán)境的影響。其中，基因遺傳因素被認為是影響其發(fā)病的主要原因，HD屬于典型的多基因遺傳病。目前，已經(jīng)有十余種基因和4個區(qū)域被證實與HD的發(fā)病有關，如RET、EDNRB、EDN3、GDNF、SOX1

3、0、ECE-1、Neurturin、9q31等。 近年來，RET基因已經(jīng)被證實是HD的主要致病基因。RET基因編碼一種酪氨酸激酶受體，該受體為跨膜蛋白聚合體，有1114個氨基酸殘基構成，其主要功能是轉(zhuǎn)導細胞生長和分化信號，在細胞外環(huán)境和細胞核之間起連接作用。據(jù)國外資料統(tǒng)計，家族性HD約40-50％存在RET基因突變，散發(fā)性為15-20％。 至今，國外的研究已發(fā)現(xiàn)90多種RET基因突變類型，散發(fā)于20個外顯子中，突變方式除

4、個別為大片段缺失外，多數(shù)為點突變。近年來，還發(fā)現(xiàn)RET基因上的一些特殊單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位點與HD具有緊密的關聯(lián)，如外顯子2上的A45A，外顯子13上的L769L。2005年，Chakravarti等通過對126個HD家系的研究，發(fā)現(xiàn)RET基因內(nèi)含子1中6個SNPs與HD密切相關，特別是RET+3位點。該位點位于多種屬保守序列MCS+9.7內(nèi)，具有重要意義。迄今為止，國內(nèi)對

5、HD患者RET基因突變的研究已有報道，但對RET基因上多態(tài)性位點與HD關聯(lián)性的研究尚未見報道。 EDNRB基因位于13q22，長約24kb，含7個外顯子和6個內(nèi)含子，其編碼的蛋白為G蛋白偶聯(lián)的跨膜受體，包括七個跨膜區(qū)。EDNRB及其配體介導的信號通路對腸神經(jīng)節(jié)細胞的發(fā)育具有重要的作用。已有實驗證實，EDNRB基因缺失可以使實驗鼠產(chǎn)生巨結腸，并且該動物模型比RET基因缺失產(chǎn)生的HD模型，更接近于人類的HD表型。而位于20號染色體的

6、EDN3基因則編碼EDNRB蛋白最為重要的配體EDN3，如EDN3基因編碼區(qū)發(fā)生突變，引起蛋白功能改變或者蛋白前體不能水解為功能性蛋白，則同樣會對EDNRB/EDN3信號通路產(chǎn)生影響，引起HD的發(fā)生。至今，國外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)17種EDNRB基因突變型，突變率5-10％，而EDN3基因突變型更為少見，約6種。至今，對中國人HDEDNRB與EDN3基因的突變研究尚少。 研究目的：(1)研究中國人散發(fā)性HDEDNRB、EDN3基因突變類

7、型、突變方式和突變率等特征，探討HD的發(fā)病機理，揭示中國人散發(fā)性HD與EDNRB、EDN3基因突變的關系。(2)研究中國人散發(fā)性HD與RET基因上SNP位點RET+3、rs2506004、rs2506005的關聯(lián)性，揭示SNP位點在中國人散發(fā)性HD發(fā)病中所起的重要作用，并尋找與HD相關的單倍體型。 研究方法：收集臨床確診的散發(fā)性HD患兒和正常對照兒童外周血，鹽析法提取基因組DNA，應用聚合酶鏈反應—單鏈構象多態(tài)性分析(polym

8、erasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)技術，對EDNRB基因全部七個外顯子以及EDN3基因兩個外顯子進行突變篩查，并對發(fā)現(xiàn)異常泳動帶的樣本進行DNA測序，以明確突變類型；應用PCR-直接測序技術，對收集到的病例與正常對照樣本進行RET+3、rs2506004和rs2506005位點的基因型分析，統(tǒng)計等位基因頻率，再運用SHEsis軟件(http：

9、//202.120.7.14/analysis/myAnalysis.php)進行等位基因頻率、位點連鎖不平衡以及單倍體頻率分析。 研究結果：在75例散發(fā)性HD中應用PCR-SSCP分析EDNRB及EDN3基因，發(fā)現(xiàn)8例樣本具有異常泳動條帶。經(jīng)測序證實，6例患者攜帶L831L的同義突變，此突變已經(jīng)被確認為單核苷酸多態(tài)性位點，人群基因頻率為0.5；2例患者攜帶V553M的錯義突變，此突變位于蛋白的跨膜區(qū)域，國外人群研究結果中未見報

10、道，可能是中國人所特有，突變頻率為2/75(2.8％)。EDN3基因上未有突變被發(fā)現(xiàn)。 對132例正常樣本和99例散發(fā)性HD患者進行RET+3位點的基因分型，結果發(fā)現(xiàn)正常人群以TC基因型為主，T等位基因頻率為45％，C等位基因頻率為55％；病例樣本以TT基因型為主，T等位基因頻率為72％，C等位基因頻率為28％。Rs2506005位點在正常人群中以CT基因型為主，C等位基因頻率為45％，T等位基因頻率為55％；病例樣本CC基因型

11、為主，C等位基因頻率為72％，T等位基因頻率為28％。Rs2506004位點在正常人群中以AC基因型為主，A等位基因頻率為45％，C等位基因頻率為55％；病例樣本以AA基因型為主，A等位基因頻率為72％，C等位基因頻率28％。這三個位點完全連鎖不平衡，構成TCC，CTA兩種單倍體型。后者與HD相關(Fisher'sExactP=1.81×10-8，＜＜0.0001)，男性人群增加5.1倍的發(fā)病風險，女性人群增加2.1倍的發(fā)病風險。