1、潰瘍性結腸炎(UC)是一種非特異性的結腸炎癥，病變主要累及結腸粘膜和粘膜下層。其病因和發(fā)病機理至今仍不清楚，目前大多數研究認為與免疫反應的異常有關。各種生化介質，包括細胞因子，生長因子，粘附分子，一氧化氮等在介導這一異常的免疫反應中起著重要作用。 許多研究己證實核轉錄因子-κB(NF-κB)在UC的發(fā)展中對炎癥介質中調節(jié)起著重要的作用。NF-κB是由二個亞單位組成的同源或異源二聚體，是一類能與多種基因啟動子位點發(fā)生特異結合并增強

2、其轉錄的一種蛋白質因子，大多數細胞因子基因啟動子部位都含有NF-κB結合位點，在細胞未受到刺激時，存在于細胞漿內未活化的NF-κB被其抑制蛋白IκB結合，當細胞受相應的刺激后，IκB被降解，NF-κB被釋放，移位至細胞核內與基因κB位點結合，促進相關基因的轉錄。 因此，從NF-κB角度研究潰瘍性結腸炎的發(fā)病機理進而尋找治療新策略和新藥物是潰瘍性結腸炎研究的新方向，具有深遠的理論意義和臨床實用價值。 對于UC的治療，氨基水

3、楊酸類、激素是常用有效控制癥狀藥物，但這些藥物并不能影響該病自然病程，最近幾年UC的分子病理機制研究取得了長足的進展，UC的生物基因治療有了很大發(fā)展。 隨著對腸黏膜免疫的深入研究，越來越多證據顯示腸黏膜上皮細胞(IEC)不僅作為固有屏障，而且也作為免疫活性細胞參加腸黏膜天然免疫反應。TLR4是新近發(fā)現的天然免疫系統(tǒng)中的細胞跨膜受體，是聯系天然免疫與后天免疫的橋梁。TLR4能介導腸上皮細胞對細菌胞壁主要成分脂多糖(lipopoly

4、saccharide，LPS)的產生高反應性，最終導致NF-κB激活，所以TLR4是將LPS信號由胞外傳向胞內的關鍵信號分子。而IL-8是一種重要的炎癥趨化因子，能趨化腸粘膜固有層炎性細胞，放大了免疫反應，其表達受細胞內激活的NF-κB調控。本課題通過對潰瘍性結腸炎患者腸黏膜上皮細胞中TLR4、IL-8、NF-κB p65的表達，及三者之間相互關系的研究，以探討其在UC發(fā)病機理中的作用。由于原代培養(yǎng)結腸上皮細胞非常困難，體外研究腸上皮細

5、胞生物學活性時，多采用與腸上皮細胞生物學特性相似的結腸腺癌細胞進行研究。我們選用了與正常腸上皮細胞具有相似細胞免疫學特性的，并且對LPS敏感，經LPS刺激后高表達TLR4的人結腸腺癌細胞系SW480細胞，用LPS刺激SW480細胞，在體外模擬腸道炎癥環(huán)境，探討NF-κB decoyODNs對炎癥狀態(tài)時的SW480細胞NF-κB p65 DNA結合活性和SW480細胞分泌TLR4、IL-8表達的影響。 第一部分：TLR4、IL-8

6、、NF-κB p65在潰瘍性結腸炎中的表達 目的：通過檢測人正常結腸粘膜和不同程度的UC結腸粘膜TLR4、IL-8、NF-κB p65的表達差異，探討三者在UC發(fā)病機制中的作用。 方法：收集UC病例及正常對照結腸鏡活檢標本或手術標本。采用免疫組化法檢測TLR4、IL-8、NF-κB p65的表達。根據Powell-Tuck等評分系統(tǒng)定量計算疾病活動度(DAI)的分值。按照Truelove-Richards標準進行病理學分

7、級。 結果： 1、對照組結腸粘膜上皮細胞和固有層TLR4、IL-8、NF-κB p65染色均為淺棕黃色，OD值分別為(0.108±0.007；0.103±0.021；0.110±0.038)，在UC組結腸粘膜表面上皮細胞和固有層TLR4、IL-8、NF-κB p65染色為深棕黃色，OD值較對照組表達均顯著增強(P<0.05)。 2、TLR4、IL-8、NF-κB p65表達的OD值分別與DAI呈正相關，(r=0.

8、819，p=0.001；r=0.948，.p=0.0001；r=0.945，p=0.0001)。TLR4、IL-8、NF-κB p65表達的OD值與病理分級有關，Ⅲ級、Ⅱ級與Ⅰ級比較、Ⅲ級與Ⅱ級比較差異均有顯著性(p<0.05)。TLR4、IL-8和NF-κB p65呈正相關(r=0.857，P=0.0001；r=0.980，P=O.0001)o 第二部分：NF-κB decoy ODNs對LPS刺激SW480細胞后NF-κB

9、p65 DNA結合活性的影響 目的：研究NF-κB decoy寡核苷酸對LPS刺激SW480后，對NF-κB p65DNA結合活性的影響。 方法： 1、體外培養(yǎng)SW480細胞， 2、ODN序列設計合成NF-κB decoy ODNs：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5' Scrambled decoy ODNs：5'-AGTTGA

10、GGACACTTTACCAGGC-3'3'-TCAACTCCTGTGAAATGGTCCG-5' 3、用LPS(10μg/L)刺激后，用脂質體lipofectin2000介導NF-κB decoyODNs轉染。 4、實驗分組：對照組(加入同等體積含同等劑量的無血清無抗生素1640培養(yǎng)液)；LPS組：LPS刺激3h；NODN組：LPS刺激3h后轉染1μmol/L的NF.r.B decoy ODNs；SODN組：LPS刺激3h

11、后轉染1μmol/L的Scrambled ODNs；lipofectin2000組：LPS刺激3h后加入同等劑量lipofectin2000。轉染6h。 5、TransAMTM法檢測細胞核NF-κB p65的DNA結合活性和Western blot法檢測NF-κB p65細胞核含量。 結果： 1、LPS刺激SW480細胞后SW480中NF-κB P65 DNA結合活性明顯高于對照組(P<0.01)，而且NF-κB

12、P65蛋白表達明顯高于對照組(P<0.01)。 2、NF-κB decoy ODNs轉染后，SW480細胞NODN組的NF-κBP65 DNA結合活性顯著低于LPS組(P<0.01)，但是NF-κB P65蛋白表達與LPS組無明顯差異(P>0.05)。 3、Scrambled decoy ODNs組和lipofectin2000組對NF-κB P65 DNA結合活性和NF-κB P65蛋白表達與LPS組間無明顯差異(P>

13、0.05)。 第三部分：NF-κB decoy ODNs對LPS刺激SW480細胞后TLR4、IL-8表達的影響 目的：研究NF-κB decoy ODNs對LPS刺激SW480細胞后，對TLR4、IL-8表達的影響。 方法： 1、體外培養(yǎng)SW480細胞， 2、ODN序列設計合成NF-κB decoy ODNs：5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'3'-TCAACTCCCCTG

14、AAAGGGTCCG-5'Scrambled decoy ODNs：5'-AGTTGAGGACACTTTACCAGGC-3'3'-TCAACTCCTGTGAAATGGTCCG-5' 3、用LPS(10μg/L)刺激后，用lipofectin2000介導NF-κB decoy ODNs轉染。 4、實驗分組：對照組(加入同等體積含同等劑量的無血清無抗生素1640培養(yǎng)液)；LPS組：LPS刺激3h；NODN組：LPS刺激3h后

15、轉染1μmol/L的NF-κB decoy ODNs；SODN組：LPS刺激3h后轉染1μmol/L的Scrambled ODNs；lipofectin2000組：LPS刺激3h后加入同等劑量lipofectin2000。轉染6h。 5、收集細胞上清液，用ELISA法檢測IL-8；提取細胞mRNA，經RT-PCR法檢測TLR4mRNA、IL-8mRNA的表達。 結果： 1、LPS刺激SW480細胞后，TLR4mR

16、NA、IL-8mRNA和IL-8的表達較對照組明顯增高(P<0.01)。 2、NF-κB decoy ODNs明顯的抑制了LPS刺激SW480細胞后TLR4mRNA、IL-8mRNA和IL-8的高表達(P<0.01)。 3、各組實驗中用Scrambled decoy ODNs和lipofectin2000干預對TLR4、IL-8都無明顯的影響(P>0.05)。 結論： 1、在UC腸粘膜中TLR4、IL-8

17、、NF-κB p65表達顯著上調，說明TLR4、IL-8、NF-κB p65參與了UC的發(fā)生和發(fā)展。 2、在UC中，TLR4、IL-8與NF-κB p65呈正相關。證實NF-κB p65在UC發(fā)生發(fā)展中是一種重要的轉錄因子，調節(jié)UC腸上皮炎癥反應的基因。 3、NF-κB decoy ODNs在體外明顯抑制LPS刺激SW480細胞后的NF-κBp65的DNA結合活性。 4、NF-κB decoy ODNs在體外明顯