1、肝纖維化(hepatic fibrosis)是多種致病因子引起慢性肝病，進而發(fā)展為肝硬化的共同病理途徑，其實質是肝臟內病理性細胞外間質(extraceUular matrix，ECM)的合成和降解失衡，表現為ECM的大量沉積，其中膠原占沉積ECM的80％以上，膠原中的Ⅰ型膠原占沉積ECM的70％以上。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是膠原合成和降解的關鍵細胞，因此調控HSC的膠原代謝是預防和逆轉肝纖維化的

2、關鍵。 HSC的膠原合成和降解主要受基質金屬蛋白酶調控，MT1-MMP(membrane-type matrix metalloproteinase-1，MT1-MMP)是近年新發(fā)現的可以降解Ⅰ型膠原的膜型基質金屬蛋白酶，它還可以通過激活MMP2(matrixmetalloproteinase-2，MMP2．)來促進膠原的降解；TIMP-2(tissue inhibitors of matrix metalloproteinas

3、ea-2，TIMP-2)是MT1-MMP和MMP2的共同抑制因子，它可以通過抑制二者對膠原的降解上調膠原的合成。 HSC的膠原代謝受多條信號轉導通路調節(jié)，粘著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)處于整合素、生長因子等信號通路的交匯點?；A研究表明，FAK磷酸化后，對多種類型細胞的膠原代謝具有重要影響，其第397酪氨酸位點(Tyr<,397>)是自主磷酸化位點，該位點磷酸化后，可以順次激活其余磷酸化位點，放

4、大FAK催化活性。因此，可以說，Tyr<,397>是FAK發(fā)揮生物學功能的扳機點。 FAK的C-末端含有粘著斑激酶相關非激酶(FAK-relatednon-kinase，FRNK)，FRNK可以作為FAK的一種內源性抑制因子，參與體內FAK功能的負向調節(jié)。對許多細胞類型來說，FRNK的過量表達能夠影響其膠原代謝，但是FRNK對HSC膠原代謝的影響及其調控機制尚不清楚。 為此，應用體外細胞培養(yǎng)技術，在脂質體介導下將FRNK質粒瞬時

5、轉染HSC，研究選擇性抑制FAK磷酸化對纖維連接蛋白(fibronectin，FN)刺激的HSC膠原代謝的影響，以及該過程中某些信號轉導分子的作用。 目的： 應用FRNK質粒瞬時轉染HSC，探討FRNK選擇性抑制FAK磷酸化對FN刺激的HSC膠原代謝的影響，以及該過程中MMP2、TIMP-2、MT1-MMP的表達變化。 方法： 應用含2％胎牛血清、100 IU·mL<'-1>青霉素、100μg·mL<'-

6、1>鏈霉素、4mmol·L<'-1>谷氨酰胺及1 mol·L<'-1>HEPES的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5％CO<,2>條件下體外培養(yǎng)HSC。以FN刺激HSC增殖，根據Lipofectamine<' >Reagent提供的實驗操作步驟，在脂質體介導下進行FRNK質粒轉染。實驗分5組：①對照組(Con組)；②FN組(FN組)；③脂質體組(Lip組)；④空質粒組(nFRNK組)；⑤FRNK質粒組(FRNK組)。②～⑤組中FN濃度

7、均為50μg·mL<'-1>。采用3H脯氨酸摻入技術測定各組HSC總膠原和Ⅰ型膠原的合成；Western blot及RT-PCR共擴增技術檢測FRNK、MMP2、TIMP-2、MT1-MMP蛋白及其mRNA表達。 結果： 1、FRNK成功轉染HSC：Western blot顯示，在125 kD位置出現FAK雜交帶，光密度值分析結果顯示，FAK蛋白表達量于轉染后0 h、24 h、48 h、72 h無明顯變化，.P>0.50

8、。同時在42 kD處出現FRNK雜交帶，隨轉染時間延長，FRNK表達逐漸增強，轉染后48 h表達最強，72 h減弱，經統(tǒng)計學處理有顯著性差異，P<0.01。說明FRNK轉染HSC成功，于轉染后48 h其表達最強，而FAK蛋白表達在轉染前后無明顯變化。 2、FRNK抑制HSC總膠原的合成：采用<'3>H脯氨酸摻入技術測定各組HSC總膠原的合成，發(fā)現經FN處理后，FN組總膠原的合成顯著高于對照組，P<0.01，FN組、脂質體組與空質

9、粒組無顯著差異，P>0.05；而在FRNK轉染HSC 48h后總膠原的合成較空質粒組有顯著下降，P<0.01.。表明在FN刺激下HSC總膠原的合成增加，用FRNK轉染FN刺激的HSC可有效抑制其總膠原的合成。 3、FRNK抑制HSC Ⅰ型膠原的合成：采用<'3>H脯氨酸摻入技術測定各組HSC Ⅰ型膠原的合成，發(fā)現經FN處理后，FN組I型膠原的合成顯著高于對照組，P<0.05，FN組、脂質體組與空質粒組無顯著差異，.P>0.05；

10、而在FRNK轉染HSC 48 h后Ⅰ型膠原的合成較空質粒組有顯著下降，P<0.01。表明在FN刺激下HSC Ⅰ型膠原的合成增加，用FRNK轉染FN刺激的HSC可有效地抑制其Ⅰ型膠原的合成。 4、FRNK上調MT1-MMP表達：Western blot顯示在66kD位置出現一條雜交帶，經光密度測定分析顯示：FN刺激后，HSC MT1-MMP蛋白表達量明顯低于對照組(1.02±0.18vs 1.55±0.27)，降低了34.19％，

11、P<0.01；但與脂質體組、空質粒組比較無明顯差異，P>0.05。FRNK質粒轉染HSC 48 h后，MT1-MMP蛋白表達量顯著升高(2.25±0.54 vs0.99±0.88)，較空質粒組升高51.77％，經統(tǒng)計學處理有顯著性差異，P<0.01。FRNK質粒轉染HSC 10 h后，RT-PCR共擴增檢測MT1-MMP和內參照β-actin的基因表達，掃描結果分析顯示：FN刺激后，HSC MT1-MMP mRNA表達量明顯低于對照組(

12、0.99±0.14 vs 1.26±0.17)，P<0.01。FN組、脂質體組與空質粒組之間無明顯差異，P>0.50；FRNK質粒組MT1-MMP mRNA表達較空質粒組明顯增加(1.58±0.18.vs1.00±0.10)，有明顯統(tǒng)計學意義，P<0.01。 5、FRNK上調MMP2的表達：Westem blot顯示在62 kD位置出現一條雜交帶，經光密度測定分析顯示：FN刺激后，HSC MMP2蛋白表達量明顯低于對照組(1.1

13、3±0.17 vs1.46±0.20)，降低了22.60％，P<0.01；但與脂質體組、空質粒組比較無明顯差異，P>0.05。FRNK質粒轉染HSC 48 h后，MMP2蛋白表達量顯著升高(2.26±0.14 vs 1.09±0.15)，較空質粒組升高51.77％，經統(tǒng)計學處理有顯著性差異，P<0.01。FRNK質粒轉染HSC 10 h后，RT-PCR共擴增檢測MMP2和內參照β-actin基因表達，掃描結果分析顯示：FN刺激后，HSC

14、 MMP2 mRNA表達量明顯低于對照組(0.97±0.07 vs1.26±0.10)，P<0.01。FN組、脂質體組與空質粒組之間無明顯差異，P>0.50；FRNK質粒組MMP2 roRNA表達較空質粒組明顯增加(1.65±0.04 vs 0.99±0.03)，有明顯統(tǒng)計學意義，P<0.01。 6、FRNK抑制TIMP-2蛋白表達：Western blot顯示在21 kD位置出現一條雜交帶，經光密度測定分析顯示：FN刺激后，H

15、SC TIMP-2蛋白表達量明顯高于對照組(2.26±0.13 vs1.44±0.09)，升高了36.28％，P<0.01；但與脂質體組、空質粒組比較無明顯差異，P>0.05。FRNK質粒轉染HSC 48 h后，TIMP-2蛋白表達量顯著降低(1.14±0.10 vs 2.23±0.15)，較空質粒組升高48.88％，經統(tǒng)計學處理有顯著性差異，P<0.01。FRNK質粒轉染HSC 10 h后，RT-PCR共擴增檢測TIMP-2和內參照B

16、.actin基因表達，掃描結果分析顯示，FN刺激后，HSC MMP2蛋白表達量明顯低于對照組，P<0.01。FN組、脂質體組與空質粒組之間無明顯差異，P>0.50；FRNK質粒組TIMP-2 mRNA表達較空質粒組明顯降低(0.97±0.04 VS1.69±0.04)，有明顯統(tǒng)計學意義，P<0.01。 7、MMP2/TIMP-2比值升高：分別把各組中MMP2、TIMP-2翻譯和轉錄水平的表達作一比值，可見在翻譯和轉錄水平，外源性