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文檔簡介
1、背景:氣道平滑肌細(xì)胞(Airway smooth muscle cell,ASMC)異常過度增殖是支氣管哮喘(哮喘)氣道重塑的重要特征。自1922年首次在尸檢中發(fā)現(xiàn)哮喘致死患者的氣道平滑肌層顯著增厚,接下來的眾多研究也證實(shí)了各階段哮喘患者均存在不同程度的氣道平滑肌容量增加。增厚的氣道平滑肌收縮能力增強(qiáng),且對變應(yīng)原的反應(yīng)性增加;同時平滑肌層增厚導(dǎo)致氣道管徑變窄,氣流受限程度加劇。氣道平滑肌過度增殖與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān),是導(dǎo)致氣流受限向不可逆
2、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前治療哮喘的瓶頸在于,雖然糖皮質(zhì)激素、支氣管舒張劑能夠很好地控制和緩解哮喘發(fā)作,但無法阻止和逆轉(zhuǎn)不可逆氣流受限的發(fā)展。抑制氣道平滑肌增殖可能成為治療哮喘的新靶點(diǎn),因此,研究ASMC增殖的機(jī)制十分必要。在哮喘的炎性氣道環(huán)境中,多種因素可引起ASMC增殖增加,主要有:生長因子、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、以及多種酶類。這些有絲分裂原作用于細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體,引起下游一系列信號通路的激活,其中研究的最多的是細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ext
3、racellular signal-regulated kinase,ERK)通路。細(xì)胞外信號經(jīng)傳導(dǎo)、放大、整合后入核,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子釋放,細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表達(dá),推動細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂周期而完成增殖過程。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的重要成員,以往認(rèn)為其主要作用是調(diào)節(jié)血壓及體液平衡。近年來的大量研究證實(shí),AngⅡ還與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、分化、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)行為有關(guān)。有研究表
4、明,哮喘發(fā)作時伴有肺臟局部RAS的活化,血漿AngⅡ水平升高。AngⅡ與ASMC增殖是否存在關(guān)聯(lián),目前的研究結(jié)果并不明確,且其機(jī)制尚未充分闡明。本研究將AngⅡ、AngⅡ受體拮抗劑Losartan、ERK激酶抑制劑PD98059分別或同時作用于原代培養(yǎng)的人ASMC,從活細(xì)胞酶水平、細(xì)胞周期兩個層面檢測細(xì)胞增殖情況,檢測Cycling D1mRNA及蛋白表達(dá)水平,并檢測ERK磷酸化水平,旨在探討AngⅡ?qū)SMC增殖的影響并初步探討其作用
5、機(jī)制。
目的:①原代培養(yǎng)人ASMC,并觀察其在體外培養(yǎng)時的特點(diǎn),并鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞;②探討AngⅡ?qū)θ薃SMC增殖的作用,并觀察AngⅡ受體拮抗劑Losartan、ERK激酶抑制劑PD98059對上述作用的影響;觀察AngⅡ?qū)θ薃SMC細(xì)胞周期的影響,及Losartan、PD98059的作用;③分別從mRNA及蛋白水平檢測AngⅡ?qū)θ薃SMC細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)表達(dá)的影響,及Losartan、P
6、D98059的作用;④檢測AngⅡ?qū)θ薃SMC細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化水平的影響,及Losartan、PD98059的作用;
方法:⑴原代培養(yǎng):取肺葉切除術(shù)患者手術(shù)標(biāo)本,無菌條件下分離葉、段支氣管中膜平滑肌層,剪成約1mm3大小貼于培養(yǎng)瓶底,間隔約0.5cm,加入含20%胎牛血清的DMEM,置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng);⑵傳代培養(yǎng):待細(xì)胞從組織塊周圍爬出并生長融合,占培養(yǎng)皿底面積的70~80%時,以1∶2~1∶
7、4傳代于培養(yǎng)瓶,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng);⑶細(xì)胞純化:細(xì)胞純化采用機(jī)械刮除法、差異貼壁法及自然純化;⑷細(xì)胞鑒定:用免疫熒光法對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行平滑肌特異的α肌動蛋白(α-SMA)特異性染色,鑒定其是否為平滑肌細(xì)胞;⑸后續(xù)處理:取3-6代對數(shù)生長期細(xì)胞,以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板或1×104/cm2接種于培養(yǎng)皿,用于實(shí)驗(yàn)研究;⑹按上述方法接種于96孔板的細(xì)胞用于MTT(四甲基偶氮唑鹽)法細(xì)胞增殖檢測,接種于60mm培養(yǎng)皿的細(xì)
8、胞用于細(xì)胞周期檢測;⑺以10-8~10-5mol/L濃度梯度的AngⅡ作用于細(xì)胞24h,檢測細(xì)胞增殖情況,觀察各個濃度AngⅡ?qū)?xì)胞增殖的影響;⑻細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組,給予相應(yīng)干預(yù)劑刺激24h后,進(jìn)行增殖檢測;⑼培養(yǎng)結(jié)束后用多功能酶標(biāo)儀檢測各組490nm波長處吸光度值,以A490表示;⑽流式細(xì)胞術(shù)PI單染法分析處于細(xì)胞周期不同階段的
9、細(xì)胞百分比;⑾各組數(shù)據(jù)用((x)±s)表示,方差齊時多組間比較采用F檢驗(yàn),多重比較采用q檢驗(yàn),方差不齊時方差分析采用Welch法,多重比較采用Dunnett T3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;⑿上述細(xì)胞接種于35mm/60mm培養(yǎng)皿,生長至培養(yǎng)皿底面積70-80%時用于提取總RNA或蛋白;⒀檢測Cyclin D1 mRNA表達(dá):用接種于35mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,實(shí)時熒光定量
10、PCR對Cyclin D1特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增,讀取各組CT值,計算2-ΔΔCT表示Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)量;⒁用接種于60mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白,Westem Blot檢測各組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平,以β-actin作為內(nèi)參,計算CyclinD1與β-actin條帶灰度值之比表示Cyclin D1蛋白表達(dá)水平;⒂數(shù)據(jù)以((x)±s)表示,進(jìn)行方差分析比較組間差異,方差齊時采用F檢驗(yàn),多重比較采用q檢驗(yàn),方
11、差不齊時采用Welch法,多重比較采用DunnettT3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;⒃細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿,生長至培養(yǎng)皿底面積70-80%時進(jìn)行信號通路檢測;⒄提取細(xì)胞總蛋白,Western Blot檢測各組ERK及p-ERK水平,計算p-ERK與ERK條帶灰度值之比表示ERK磷酸化水平,即ERK通路活化情況;⒅?jǐn)?shù)據(jù)以((x)±s)表示,進(jìn)行方差分析比較組間差異,方差齊時采用F檢驗(yàn),多重比較采用q檢驗(yàn)
12、,方差不齊時采用Welch法,多重比較采用DunnettT3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:①2~3周后,貼于培養(yǎng)瓶底部的平滑肌組織塊周圍陸續(xù)可見細(xì)胞爬出,普通光鏡下觀察,細(xì)胞貼壁生長,呈長梭形,卵圓形胞核位于細(xì)胞中央,可見1個或多個核仁;②細(xì)胞繼續(xù)生長1周左右,相鄰組織塊爬出的細(xì)胞開始融合,傳代后12h觀察,細(xì)胞貼壁良好,2~3天后融合,排列規(guī)律呈典型“峰谷征”;③細(xì)胞免疫熒光染色95
13、%以上細(xì)胞α-SMA表達(dá)陽性;④以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板或1×104/cm2接種于培養(yǎng)皿,24h后可覆蓋培養(yǎng)物底部面積的70-80%;⑤對照組、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L濃度組細(xì)胞A490值分別為:0.396±0.029、0.416±0.035、0.500±0.050、0.483±0.059、0.450±0.051;與對照組相比,10-7~10-5mol/L濃度的AngⅡ均可引起ASMC增殖顯著增加,差異
14、有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),其中10-7mol/L濃度的AngⅡ作用最為明顯;⑥不同干預(yù)劑作用24h后,對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組細(xì)胞A490值分別為:0.386±0.021、0.531±0.043、0.380±0.019、0.395±0.018、0.393±0.024、0.389±0.028,其中AngⅡ組高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0
15、1),Losartan組及PD98059組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,AngⅡ+Losartan組及AngⅡ+PD98059組低于AngⅡ組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01);⑦不同干預(yù)劑作用24h后,對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)水平分別為:1.00±0.17、1.57±0.26、0.95±0.09、0.91±0.2
16、1、0.77±0.09、0.84±0.04,與對照組相,比,AngⅡ組Cyclin D1 mRNA表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),Losartan組及PD98059組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,與AngⅡ組相比,AngⅡ+Losartan組及AngⅡ+PD98059組Cyclin D1 mRNA表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01);⑧干預(yù)劑作用24h后,對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan
17、組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平分別為:0.224±0.074、0.527±0.082、0.312±0.036、0.291±0.094、0.286±0.059、0.226±0.047,與對照組相比,AngⅡ組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),Losartan組及PD98059組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,與AngⅡ組相比,AngⅡ+Losartan組及Ang
18、Ⅱ+PD98059組Cyclin D1蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01);⑨不同干預(yù)劑作用15min后,對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組ERK磷酸化水平分別為:0.306±0.049、0.641±0.153、0.245±0.053、0.212±0.073、0.221±0.036、0.211±0.060,與對照組相比,AngⅡ組ERK磷酸化水平
19、升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),Losartan組及PD98059組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,與AngⅡ組相比,AngⅡ+Losartan組及AngⅡ+PD98059組ERK磷酸化水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。
結(jié)論:⑴組織塊貼壁法培養(yǎng)ASMC周期約為1個月,5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板或1×104/cm2接種于培養(yǎng)皿是合適的接種密度;細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色鑒定,表達(dá)平滑肌特異的α-SMA,純度達(dá)9
20、5%;⑵AngⅡ可引起人ASMC增殖增加,以10-7mol/L濃度作用最為明顯;AngⅡ處理組較對照組細(xì)胞總數(shù)增加,同時處于G0G1期的細(xì)胞百分比減少,S及G2M期細(xì)胞百分比增加;阻斷AngⅡ受體或ERK信號通路均可逆轉(zhuǎn)AngⅡ的促增殖效應(yīng);⑶AngⅡ可誘導(dǎo)人ASMC Cyclin D1 mRNA及蛋白合成增加;阻斷AngⅡ受體或ERK信號通路均可消除AngⅡ?qū)yclin D1的影響;⑷AngⅡ可活化ERK通路,使ERK磷酸化水平升高
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