1、背景：氣道平滑肌細(xì)胞（Airway smooth muscle cell，ASMC）異常過度增殖是支氣管哮喘（哮喘）氣道重塑的重要特征。自1922年首次在尸檢中發(fā)現(xiàn)哮喘致死患者的氣道平滑肌層顯著增厚，接下來的眾多研究也證實(shí)了各階段哮喘患者均存在不同程度的氣道平滑肌容量增加。增厚的氣道平滑肌收縮能力增強(qiáng)，且對變應(yīng)原的反應(yīng)性增加;同時平滑肌層增厚導(dǎo)致氣道管徑變窄，氣流受限程度加劇。氣道平滑肌過度增殖與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)，是導(dǎo)致氣流受限向不可逆

2、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前治療哮喘的瓶頸在于，雖然糖皮質(zhì)激素、支氣管舒張劑能夠很好地控制和緩解哮喘發(fā)作，但無法阻止和逆轉(zhuǎn)不可逆氣流受限的發(fā)展。抑制氣道平滑肌增殖可能成為治療哮喘的新靶點(diǎn)，因此，研究ASMC增殖的機(jī)制十分必要。在哮喘的炎性氣道環(huán)境中，多種因素可引起ASMC增殖增加，主要有:生長因子、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、以及多種酶類。這些有絲分裂原作用于細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體，引起下游一系列信號通路的激活，其中研究的最多的是細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ext

3、racellular signal-regulated kinase，ERK)通路。細(xì)胞外信號經(jīng)傳導(dǎo)、放大、整合后入核，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子釋放，細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表達(dá)，推動細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂周期而完成增殖過程。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的重要成員，以往認(rèn)為其主要作用是調(diào)節(jié)血壓及體液平衡。近年來的大量研究證實(shí)，AngⅡ還與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、分化、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)行為有關(guān)。有研究表

4、明，哮喘發(fā)作時伴有肺臟局部RAS的活化，血漿AngⅡ水平升高。AngⅡ與ASMC增殖是否存在關(guān)聯(lián)，目前的研究結(jié)果并不明確，且其機(jī)制尚未充分闡明。本研究將AngⅡ、AngⅡ受體拮抗劑Losartan、ERK激酶抑制劑PD98059分別或同時作用于原代培養(yǎng)的人ASMC，從活細(xì)胞酶水平、細(xì)胞周期兩個層面檢測細(xì)胞增殖情況，檢測Cycling D1mRNA及蛋白表達(dá)水平，并檢測ERK磷酸化水平，旨在探討AngⅡ?qū)SMC增殖的影響并初步探討其作用

5、機(jī)制。
　　 目的：①原代培養(yǎng)人ASMC，并觀察其在體外培養(yǎng)時的特點(diǎn)，并鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞;②探討AngⅡ?qū)θ薃SMC增殖的作用，并觀察AngⅡ受體拮抗劑Losartan、ERK激酶抑制劑PD98059對上述作用的影響;觀察AngⅡ?qū)θ薃SMC細(xì)胞周期的影響，及Losartan、PD98059的作用;③分別從mRNA及蛋白水平檢測AngⅡ?qū)θ薃SMC細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)表達(dá)的影響，及Losartan、P

6、D98059的作用;④檢測AngⅡ?qū)θ薃SMC細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化水平的影響，及Losartan、PD98059的作用;
　　 方法：⑴原代培養(yǎng):取肺葉切除術(shù)患者手術(shù)標(biāo)本，無菌條件下分離葉、段支氣管中膜平滑肌層，剪成約1mm3大小貼于培養(yǎng)瓶底，間隔約0.5cm，加入含20％胎牛血清的DMEM，置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng);⑵傳代培養(yǎng):待細(xì)胞從組織塊周圍爬出并生長融合，占培養(yǎng)皿底面積的70～80％時，以1∶2～1∶

7、4傳代于培養(yǎng)瓶，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng);⑶細(xì)胞純化:細(xì)胞純化采用機(jī)械刮除法、差異貼壁法及自然純化;⑷細(xì)胞鑒定:用免疫熒光法對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行平滑肌特異的α肌動蛋白(α-SMA)特異性染色，鑒定其是否為平滑肌細(xì)胞;⑸后續(xù)處理:取3-6代對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板或1×104/cm2接種于培養(yǎng)皿，用于實(shí)驗(yàn)研究;⑹按上述方法接種于96孔板的細(xì)胞用于MTT（四甲基偶氮唑鹽）法細(xì)胞增殖檢測，接種于60mm培養(yǎng)皿的細(xì)

8、胞用于細(xì)胞周期檢測;⑺以10-8～10-5mol/L濃度梯度的AngⅡ作用于細(xì)胞24h，檢測細(xì)胞增殖情況，觀察各個濃度AngⅡ?qū)?xì)胞增殖的影響;⑻細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組，給予相應(yīng)干預(yù)劑刺激24h后，進(jìn)行增殖檢測;⑼培養(yǎng)結(jié)束后用多功能酶標(biāo)儀檢測各組490nm波長處吸光度值，以A490表示;⑽流式細(xì)胞術(shù)PI單染法分析處于細(xì)胞周期不同階段的

9、細(xì)胞百分比;⑾各組數(shù)據(jù)用（(x)±s）表示，方差齊時多組間比較采用F檢驗(yàn)，多重比較采用q檢驗(yàn)，方差不齊時方差分析采用Welch法，多重比較采用Dunnett T3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;⑿上述細(xì)胞接種于35mm/60mm培養(yǎng)皿，生長至培養(yǎng)皿底面積70-80％時用于提取總RNA或蛋白;⒀檢測Cyclin D1 mRNA表達(dá):用接種于35mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時熒光定量

10、PCR對Cyclin D1特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增，讀取各組CT值，計算2-ΔΔCT表示Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)量;⒁用接種于60mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，Westem Blot檢測各組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參，計算CyclinD1與β-actin條帶灰度值之比表示Cyclin D1蛋白表達(dá)水平;⒂數(shù)據(jù)以（(x)±s）表示，進(jìn)行方差分析比較組間差異，方差齊時采用F檢驗(yàn)，多重比較采用q檢驗(yàn)，方

11、差不齊時采用Welch法，多重比較采用DunnettT3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;⒃細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿，生長至培養(yǎng)皿底面積70-80％時進(jìn)行信號通路檢測;⒄提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測各組ERK及p-ERK水平，計算p-ERK與ERK條帶灰度值之比表示ERK磷酸化水平，即ERK通路活化情況;⒅?jǐn)?shù)據(jù)以（(x)±s）表示，進(jìn)行方差分析比較組間差異，方差齊時采用F檢驗(yàn)，多重比較采用q檢驗(yàn)

12、，方差不齊時采用Welch法，多重比較采用DunnettT3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①2～3周后，貼于培養(yǎng)瓶底部的平滑肌組織塊周圍陸續(xù)可見細(xì)胞爬出，普通光鏡下觀察，細(xì)胞貼壁生長，呈長梭形，卵圓形胞核位于細(xì)胞中央，可見1個或多個核仁;②細(xì)胞繼續(xù)生長1周左右，相鄰組織塊爬出的細(xì)胞開始融合，傳代后12h觀察，細(xì)胞貼壁良好，2～3天后融合，排列規(guī)律呈典型“峰谷征”;③細(xì)胞免疫熒光染色95

13、％以上細(xì)胞α-SMA表達(dá)陽性;④以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板或1×104/cm2接種于培養(yǎng)皿，24h后可覆蓋培養(yǎng)物底部面積的70-80％;⑤對照組、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L濃度組細(xì)胞A490值分別為:0.396±0.029、0.416±0.035、0.500±0.050、0.483±0.059、0.450±0.051;與對照組相比，10-7～10-5mol/L濃度的AngⅡ均可引起ASMC增殖顯著增加，差異

14、有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中10-7mol/L濃度的AngⅡ作用最為明顯;⑥不同干預(yù)劑作用24h后，對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組細(xì)胞A490值分別為:0.386±0.021、0.531±0.043、0.380±0.019、0.395±0.018、0.393±0.024、0.389±0.028，其中AngⅡ組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0

15、1)，Losartan組及PD98059組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，AngⅡ+Losartan組及AngⅡ+PD98059組低于AngⅡ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）;⑦不同干預(yù)劑作用24h后，對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組Cyclin D1 mRNA相對表達(dá)水平分別為:1.00±0.17、1.57±0.26、0.95±0.09、0.91±0.2

16、1、0.77±0.09、0.84±0.04，與對照組相，比，AngⅡ組Cyclin D1 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，Losartan組及PD98059組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與AngⅡ組相比，AngⅡ+Losartan組及AngⅡ+PD98059組Cyclin D1 mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）;⑧干預(yù)劑作用24h后，對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan

17、組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平分別為:0.224±0.074、0.527±0.082、0.312±0.036、0.291±0.094、0.286±0.059、0.226±0.047，與對照組相比，AngⅡ組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，Losartan組及PD98059組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與AngⅡ組相比，AngⅡ+Losartan組及Ang

18、Ⅱ+PD98059組Cyclin D1蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）;⑨不同干預(yù)劑作用15min后，對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組ERK磷酸化水平分別為:0.306±0.049、0.641±0.153、0.245±0.053、0.212±0.073、0.221±0.036、0.211±0.060，與對照組相比，AngⅡ組ERK磷酸化水平

19、升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，Losartan組及PD98059組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與AngⅡ組相比，AngⅡ+Losartan組及AngⅡ+PD98059組ERK磷酸化水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　 結(jié)論：⑴組織塊貼壁法培養(yǎng)ASMC周期約為1個月，5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板或1×104/cm2接種于培養(yǎng)皿是合適的接種密度;細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色鑒定，表達(dá)平滑肌特異的α-SMA，純度達(dá)9

20、5％;⑵AngⅡ可引起人ASMC增殖增加，以10-7mol/L濃度作用最為明顯;AngⅡ處理組較對照組細(xì)胞總數(shù)增加，同時處于G0G1期的細(xì)胞百分比減少，S及G2M期細(xì)胞百分比增加;阻斷AngⅡ受體或ERK信號通路均可逆轉(zhuǎn)AngⅡ的促增殖效應(yīng);⑶AngⅡ可誘導(dǎo)人ASMC Cyclin D1 mRNA及蛋白合成增加;阻斷AngⅡ受體或ERK信號通路均可消除AngⅡ?qū)yclin D1的影響;⑷AngⅡ可活化ERK通路，使ERK磷酸化水平升高