1、研究背景 嗜酸粒細胞(EOS)浸潤引起的氣道慢性炎癥是哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，EOS通過釋放嗜酸性顆粒性蛋白導致哮喘特征性的病理改變和氣道高反應性。EOS顆粒蛋白主要有：EOS陽離子蛋白(ECP)，EOS主要堿性蛋白(MBP)，EOS過氧化物酶(EPO)，以及EOS神經毒素(EDN)。在這些蛋白中，MBP是一種毒性極強的分泌蛋白，將生理數量的MBP施加至腫瘤細胞、寄生蟲和桿菌科微生物都能導致直接的毒力殺傷。MBP是導致毒蕈堿M2受體

2、功能失調的主要原因，能加強支氣管哮喘發(fā)作中副交感神經介導的強烈氣道收縮。MBP還能造成哮喘患者氣道上皮的損傷，并刺激組胺、IL-5、IL-8等炎性因子的大量釋放。因此，MBP是哮喘發(fā)病過程中關鍵的致病物質。 研究目的 臨床上傳統(tǒng)的檢測手段如肺功能、血常規(guī)、血沉并不能準確的反映哮喘時患者氣道炎癥的變化情況，如肺功能正常時，氣道炎癥未必得到了很好控制；血常規(guī)等檢查又缺乏診斷的特異性。因此，人們一直在尋找一種能特異性反映氣道炎

3、癥病變的檢測方法來取代目前的常規(guī)手段。已經證明MBP在哮喘發(fā)病中起著重要作用，作為EOS釋放的顆粒蛋白，MBP是目前最有希望反映哮喘病情嚴重程度的指標。所以在本研究中我們對不同病情的哮喘患者及正常人群外周血MBP的含量進行了測定。期待通過對MBP含量的測定，建立一種經濟、高效、方便的檢測方法對哮喘病人的病情進行評估。 研究方法 一、ELISA法檢測外周血MBP含量 選取哮喘輕度患者34例，中、重度患者28例，正常

4、對照者32例，分成三組。將受試者的血清加入96孔聚苯乙烯酶標板中，4℃包被過夜。接著加入小鼠抗人主要堿性蛋白單克隆抗體，在室溫下放置2小時。在每孔中加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠抗體。在37℃放置1小時后，加入底物顯色10分鐘，應用全自動酶標比色儀在450nm處測定光密度值，依據主要堿性蛋白標準曲線查得對應蛋白濃度，即得到各標本主要堿性蛋白含量。 二、RT-PCR及半定量分析MBPmRNA的表達 運用RT-PCR法，對

5、40例哮喘患者(輕度患者15例，中度15例，重度10例)和20例正常對照者MBPmRNA的表達進行測定。擴增人MBP引物及內參照β-actin引物均由上海鼎安生物科技公司設計并合成，其中β-actin作為內參。RNA提取及逆轉錄均按照詳細的操作指導進行。所得產物，用2％瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為陽性對照，用UVItec凝膠分析儀將電泳圖掃描后進行分析。以積分光密度IOD(目的帶)/IOD(β-actin)之比進行半定量分析。

6、 三、MBP測定與臨床相關檢測的比較 所有受試者均抽取靜脈血，進行血常規(guī)五分類檢查，按哮喘輕度組，中、重度組，正常組分類統(tǒng)計，與各組MBP含量進行比較。肺通氣功能測定使用6200AutoboxDL型體積描記儀，按規(guī)定校準后測定。按哮喘輕度組，中、重度組記錄FEV1占預計值百分比(FEV1％Pred)、PEF占預計值百分比(PEF％Pred)等肺功能檢測數據，比較不同組別肺功能的差異。再將肺功能指標和MBP測定結果進行相關分析

7、。 四、統(tǒng)計學處理 運用SPSS10.0軟件，各組結果以Mean±SD表示。兩樣本均數的比較采用t檢驗；多組比較采用單向方差分析(One-WayANOVA)；各組間比較采用LSD或Dunnetts法。檢驗水準α=0.05，P≤0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。 結果 一、ELISA法檢測外周血MBP含量結果 1、選擇標準品與空白對照OD值相差較大的一抗和二抗工作濃度，比較得出一抗1∶2000，二抗1∶

8、1000較為合適。 2、應用PBS液稀釋主要堿性蛋白標準品，標準品濃度分別為20、10、8、5、2.5、1.25、0.625、0ng/ml，相應OD值為：1.342、0.639、0.541、0.329、0.152、0.137、0.076、0.062，得到主要堿性蛋白標準曲線，主要堿性蛋白標準品濃度與OD值呈線性關系：y=15.46x-0.4145。 3、對照主要堿性蛋白標準曲線，哮喘患者輕度組；中、重度組；正常組MBP的

9、含量有顯著性差異(F=411.501，P＜0.001)。哮喘中、重度組MBP含量最高，正常組含量最低。癥狀緩解前患者體內MBP的含量(5.28±1.59ng/ml)遠高于緩解后(2.81±0.99ng/ml)。 二、RT-PCR及半定量分析結果 哮喘組患者的MBPmRNA表達水平為0.37±0.11；正常組MBPmRNA表達水平為0.17±0.04；兩組MBPmRNA表達有顯著性差異(t=7.837，P＜0.001)。不

10、同病情程度比較，中度病情哮喘組MBPmRNA表達水平(0.42±0.05)和重度哮喘組(0.47±0.05)，遠高于輕度哮喘組MBPmRNA表達水平(0.25±0.06，P＜0.01)。 三、與臨床相關指標研究結果 各組外周血嗜酸粒細胞數量和百分比存在顯著性差異，正常組最低，中重度哮喘組最高，與外周血MBP含量的趨勢一致。輕度組和哮喘重度組的肺功能主要指標FEV1％Pred、PEF％Pred具有顯著性差異(P＜0.01)

11、。外周血MBP的含量同肺功能水平呈負相關(r=-0.8730，P＜0.001)結論 一、通過ELISA法研究，MBP被證實是一種非常重要的氣道活性物質，與正常對照組相比，哮喘組外周血MBP含量顯著增高。 二、RT-PCR及半定量分析顯示，當哮喘發(fā)作時，MBP表達基因被激活，MBPmRNA大量表達；不同哮喘病情組中，MBPmRNA的表達水平不同。 三、哮喘患者外周血嗜酸粒細胞數量和百分比的增加趨勢與MBP含量的增加