1、背景 糖皮質激素抵抗是臨床上包括哮喘在內的許多慢性炎癥性疾病的治療難題，而人類對激素抵抗的分子機制仍然還未完全研究清楚。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)糖皮質激素受體beta]E型(hGRβ)相對于alpha,]E型(hGRQ)的過度表達與激素抵抗密切相關。人糖皮質激素受體外顯子9的選擇性剪接產生兩種高度同源的剪接異構體，hGRα和hGRβ。在mRNA水平上，兩者含有完全相同的前8個外顯子，反映在氨基酸序列上，兩者在氨基端有相同的727個氨基

2、酸。唯一的差別在剩余的羧基端部分：hGRQ的羧基端由外顯子9a編碼的50個氨基酸組成，而hGRβ的羧基端由外顯子9β編碼的的15個非同源氨基酸組成。這些結構上的差別使得hGRβ在功能上無法結合糖皮質激素，降低了與DNA結合的能力，使之喪失基因轉錄激活作用。在轉染細胞中，過度表達的hGRB與hGRQ形成異源二聚體從而抑制hGRQ介導的的轉錄激活作用。因此hGRβ被認為是hGRα功能的主要拮抗因子。 富含絲氨酸／精氨酸的蛋白(SRp

3、rotein)和hnRNPAl是真核生物中重要的剪接因子。它們在剪接位點的識別，外顯子保留，以及剪接位點的相互作用上發(fā)揮著重要的作用，因而成為研究前體mRNA選擇性剪接的重要候選因子。 考慮到hGRβ與激素抵抗密切關系，因此研究糖皮質激素受體前體mRNA外顯子9的選擇性剪接機制，找到決定hGRB剪接的關鍵因素對于揭開激素抵抗的分子機制具有重要意義，并能為激素抵抗的臨床治療提供可能的靶點。盡管有研究報道SR蛋白成員SRp30c對h

4、GRβ的選擇性剪接具有決定性作用，但大量hGR外顯子9選擇性剪接的調控機制仍不為人所知。 目的 1．構建hGR小基因報告載體，為進一步研究糖皮質激素受體外顯子9的選擇性剪接提供分子模型。 2．以hGR小基因報告載體作為模型，研究剪接因子SR蛋白及hnRNPAl對糖皮質激素受體外顯子9選擇性剪接的影響，尋找決定hgRβ剪接的關鍵因子。 方法 以人基因組DNA為模板，設計特定的引物進行PCR擴增獲得3

5、．892kb長的hGR小基因片段，并將其連入pMDl8一TSimple載體中，經限制性酶切鑒定后，hGR小基因片斷被亞克隆到PcDNA3載體中，獲得hGR小基因的真核表達質粒，測序驗證后命名為pcDNA3-hGR。將hGR小基因報告質粒分別與不同的SR蛋白和hnRNPAl表達質粒共轉染HeLa、293T細胞。24小時后收獲細胞，用RT一PCR半定量檢測被剪接的小基因產物hGRQ／hGRB的表達比值。 結果 1．限制性酶切

6、鑒定 用XhoI，BamHI雙酶切pcDNA3-hGR及pMDl8-T—hGR，分別得到5．4kb和2．692kb的載體片斷及3．892kb的小基因片斷，結果與理論上預期的相符。 2．DNA測序 測序結果顯示克隆的hGR小基因片斷與Genabank上的目標序列一致性為99．5％，極少數(shù)¨．I于突變或測序時誤讀所導致的堿基改變對不會對剪接造成影響。 3．hGR小基因在HeLa細胞中的表達 RT—PC

7、R擴增出了表達量豐富的hGRQ(約547bp)和表達量很少的hGRD(約353bp)兩種轉錄自hGR小基因的剪接異構體，而用同樣的引物無法擴增出細胞內源性hGRQ，hGRB剪接異構體。 4．剪接因子SR蛋白家族成員和hnRNPAl對hGR外顯子9選擇性剪接的影響 與空載體對照相比，SRp40能促進剪接時外顯子9Q的“跳躍”，而導致外顯子9β的識別增加，使hGRQ的表達百分比明顯下降(39％)而hgRβ的表達百分比明顯升高

8、(61％)，兩者的比值出現(xiàn)逆轉(P<0．01)。而包括SRp30c在內的其他剪接因子與空載體對照在hGR，h6Rβ表達上的差異不具有統(tǒng)計學意義(p>0．05)。 5．SRp40對hGRβ的剪接促進作用具有細胞特異 隨著HeLa細胞中SRp40質粒濃度的不斷增加，剪接識別機制對外顯子9a的“跳躍”也不斷增加。呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴關系。而這種由SRp40誘導的外顯子9Q的“跳躍”在293Tce¨s中并沒有觀察到。同樣在兩種細