1、目的：口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動物急性、高度傳播性疾病,由于口蹄疫病毒存在7個血清型和70多個亞型,各型間不存在交叉保護作用,所以用疫苗和傳統(tǒng)的自然育種方法很難控制此病。而且此病近年來在無口蹄疫國家的爆發(fā)給發(fā)病國和鄰近國家造成巨大的經濟損失。因此,研究并發(fā)展新的抗病毒方法以控制口蹄疫是非常必要的。RNA干擾(RNAi)是廣泛存在于生物體內的由21-23nt小雙鏈RNA誘導序列特異性的轉錄后的基因表達沉默現象,RNAi對基因表達

2、的調控、病毒感染的防護、基因轉座的控制等都具有重要的意義。RNAi從發(fā)現開始就受到病毒學研究者的高度重視,被認為是抗病毒感染最有效的方法之一。許多學者以人工誘導RNAi的方式進行了病毒復制的干擾研究,并取得了良好的進展。為了發(fā)展控制口蹄疫的新方法,本研究對口蹄疫病毒的體內外復制進行了RNA干擾的探索,在此基礎上,構建了靶向口蹄疫病毒的siRNA的轉基因小鼠模型,并對所得的轉基因鼠進行抗病毒的評價。為RNAi應用于口蹄疫病毒的基因功能研究

3、以及口蹄疫的防治積累了必要的實驗數據,為動物的抗病育種提供一條新的思路。 方法：對7個血清型的FMDV基因組序列進行同源性比較后,初步篩選7個siRNA作用的靶位點。根據siRNA表達載體pSilenter 5.1-H1 Retro對插入序列的要求,設計合成了7個針對FMDV的shRNA表達序列的DNA序列。構建針對以上靶序列的siRNA表達載體。選擇其中針對高保守的2B、3D區(qū)重組質粒瞬時轉染BHK-21單層細胞后接種0、A、

4、AsiaI型口蹄疫病毒檢測在細胞水平上表達的siRNA對病毒復制抑制效果；將重組質粒注射乳鼠后用5 LD50和20 LD50的0型、AsiaI型FMDV感染觀察小鼠死亡情況：在對細胞水平病毒繁殖有一定效果的基礎上,利用顯微注射法構建了靶向口蹄疫病毒2B、3D區(qū)的siRNA的轉基因小鼠模型。為了檢測siRNAs抗病毒的活性,我們對F1代成年鼠直接皮下接種0.5ml 100 LD50 AsiaI FMDV口蹄疫病毒,72h后小鼠經眼眶放血處

5、死,及時取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟制備常規(guī)病理切片,同時觀察病變。用免疫組織化學染色法來評價轉基因小鼠對口蹄疫病毒的抵抗作用。 結果：經酶切和序列測定,正確構建了靶向FMDV的siRNA表達載體,分別命名為：pSi-FMDV1、pSi-FMDV2、pSi-FMDV3、pSi-FMDV4、pSi-FMDV5、pSi-FMDV6、pSi-FMDV7。用大量制備的重組質粒pSi-FMD2、pSi-FMD3轉染BHK-21單層細胞

6、后接種病毒,結果發(fā)現,與對照組相比,實驗組細胞出現細胞病變現象的程度要輕；不同時間段收集的細胞上清液測得的TCID50值比對照有一定程度的降低。注射重組質粒后對小鼠攻毒可使小鼠模型發(fā)病率降低,小鼠的死亡數減少。在以上基礎上將上述兩個包含有整個表達框的siRNA片段經顯微注射法構建了轉基因小鼠模型。FMD2基因共注射506枚受精卵,移植到23只假孕母鼠輸卵管內,其中17只懷孕,產仔104只。FMD3基因共注射469枚受精卵,移植到22只假

7、孕母鼠輸卵管內,其中9只懷孕,產仔55只。所有F0代小鼠經PCR檢測,結果共有6只為陽性。轉基因親代小鼠與正常異性健康小鼠交配后,其后代鼠經PCR檢測,有20％-30％遺傳獲得轉基因；轉基因小鼠之間進行交配后,100％的后代鼠遺傳獲得轉基因。目前,FMD2基因傳代到F3代。FMD3基因已經傳至F6代,仍有2096左右轉基因陽性小鼠檢出。轉基因小鼠外表未見任何異常。對F1代成年鼠直接感染口蹄疫病毒,感染后的轉基因小鼠取組織制備石蠟切片,與

8、正常小鼠感染后的組織切片比較病理變化的程度；同時對切片進行免疫組織化學染色,檢測轉基因小鼠體內表達的siRNA對病毒復制的抑制效果。與對照相比,轉基因小鼠攻毒后各組織器官病變輕微；其中,脾臟的脾小體明顯增大,顯示轉基因小鼠體內細胞免疫功能加強；免疫組織化學結果顯示,在對照組小鼠的脾臟、肝臟和。腎臟中有病毒粒子的存在。而在轉基因小鼠,只在脾臟和肝臟中可見少量的陽性病毒粒子。 結論：以上結果表明設計的siRNA在細胞水平上和個體水平