口蹄疫病毒干擾RNA轉基因小鼠模型的構建.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩103頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、目的:口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動物急性、高度傳播性疾病,由于口蹄疫病毒存在7個血清型和70多個亞型,各型間不存在交叉保護作用,所以用疫苗和傳統(tǒng)的自然育種方法很難控制此病。而且此病近年來在無口蹄疫國家的爆發(fā)給發(fā)病國和鄰近國家造成巨大的經濟損失。因此,研究并發(fā)展新的抗病毒方法以控制口蹄疫是非常必要的。RNA干擾(RNAi)是廣泛存在于生物體內的由21-23nt小雙鏈RNA誘導序列特異性的轉錄后的基因表達沉默現象,RNAi對基因表達

2、的調控、病毒感染的防護、基因轉座的控制等都具有重要的意義。RNAi從發(fā)現開始就受到病毒學研究者的高度重視,被認為是抗病毒感染最有效的方法之一。許多學者以人工誘導RNAi的方式進行了病毒復制的干擾研究,并取得了良好的進展。為了發(fā)展控制口蹄疫的新方法,本研究對口蹄疫病毒的體內外復制進行了RNA干擾的探索,在此基礎上,構建了靶向口蹄疫病毒的siRNA的轉基因小鼠模型,并對所得的轉基因鼠進行抗病毒的評價。為RNAi應用于口蹄疫病毒的基因功能研究

3、以及口蹄疫的防治積累了必要的實驗數據,為動物的抗病育種提供一條新的思路。 方法:對7個血清型的FMDV基因組序列進行同源性比較后,初步篩選7個siRNA作用的靶位點。根據siRNA表達載體pSilenter 5.1-H1 Retro對插入序列的要求,設計合成了7個針對FMDV的shRNA表達序列的DNA序列。構建針對以上靶序列的siRNA表達載體。選擇其中針對高保守的2B、3D區(qū)重組質粒瞬時轉染BHK-21單層細胞后接種0、A、

4、AsiaI型口蹄疫病毒檢測在細胞水平上表達的siRNA對病毒復制抑制效果;將重組質粒注射乳鼠后用5 LD50和20 LD50的0型、AsiaI型FMDV感染觀察小鼠死亡情況:在對細胞水平病毒繁殖有一定效果的基礎上,利用顯微注射法構建了靶向口蹄疫病毒2B、3D區(qū)的siRNA的轉基因小鼠模型。為了檢測siRNAs抗病毒的活性,我們對F1代成年鼠直接皮下接種0.5ml 100 LD50 AsiaI FMDV口蹄疫病毒,72h后小鼠經眼眶放血處

5、死,及時取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟制備常規(guī)病理切片,同時觀察病變。用免疫組織化學染色法來評價轉基因小鼠對口蹄疫病毒的抵抗作用。 結果:經酶切和序列測定,正確構建了靶向FMDV的siRNA表達載體,分別命名為:pSi-FMDV1、pSi-FMDV2、pSi-FMDV3、pSi-FMDV4、pSi-FMDV5、pSi-FMDV6、pSi-FMDV7。用大量制備的重組質粒pSi-FMD2、pSi-FMD3轉染BHK-21單層細胞

6、后接種病毒,結果發(fā)現,與對照組相比,實驗組細胞出現細胞病變現象的程度要輕;不同時間段收集的細胞上清液測得的TCID50值比對照有一定程度的降低。注射重組質粒后對小鼠攻毒可使小鼠模型發(fā)病率降低,小鼠的死亡數減少。在以上基礎上將上述兩個包含有整個表達框的siRNA片段經顯微注射法構建了轉基因小鼠模型。FMD2基因共注射506枚受精卵,移植到23只假孕母鼠輸卵管內,其中17只懷孕,產仔104只。FMD3基因共注射469枚受精卵,移植到22只假

7、孕母鼠輸卵管內,其中9只懷孕,產仔55只。所有F0代小鼠經PCR檢測,結果共有6只為陽性。轉基因親代小鼠與正常異性健康小鼠交配后,其后代鼠經PCR檢測,有20%-30%遺傳獲得轉基因;轉基因小鼠之間進行交配后,100%的后代鼠遺傳獲得轉基因。目前,FMD2基因傳代到F3代。FMD3基因已經傳至F6代,仍有2096左右轉基因陽性小鼠檢出。轉基因小鼠外表未見任何異常。對F1代成年鼠直接感染口蹄疫病毒,感染后的轉基因小鼠取組織制備石蠟切片,與

8、正常小鼠感染后的組織切片比較病理變化的程度;同時對切片進行免疫組織化學染色,檢測轉基因小鼠體內表達的siRNA對病毒復制的抑制效果。與對照相比,轉基因小鼠攻毒后各組織器官病變輕微;其中,脾臟的脾小體明顯增大,顯示轉基因小鼠體內細胞免疫功能加強;免疫組織化學結果顯示,在對照組小鼠的脾臟、肝臟和。腎臟中有病毒粒子的存在。而在轉基因小鼠,只在脾臟和肝臟中可見少量的陽性病毒粒子。 結論:以上結果表明設計的siRNA在細胞水平上和個體水平

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論