1、目的：口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物急性、高度傳播性疾病,由于口蹄疫病毒存在7個(gè)血清型和70多個(gè)亞型,各型間不存在交叉保護(hù)作用,所以用疫苗和傳統(tǒng)的自然育種方法很難控制此病。而且此病近年來(lái)在無(wú)口蹄疫國(guó)家的爆發(fā)給發(fā)病國(guó)和鄰近國(guó)家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,研究并發(fā)展新的抗病毒方法以控制口蹄疫是非常必要的。RNA干擾(RNAi)是廣泛存在于生物體內(nèi)的由21-23nt小雙鏈RNA誘導(dǎo)序列特異性的轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)沉默現(xiàn)象,RNAi對(duì)基因表達(dá)

2、的調(diào)控、病毒感染的防護(hù)、基因轉(zhuǎn)座的控制等都具有重要的意義。RNAi從發(fā)現(xiàn)開始就受到病毒學(xué)研究者的高度重視,被認(rèn)為是抗病毒感染最有效的方法之一。許多學(xué)者以人工誘導(dǎo)RNAi的方式進(jìn)行了病毒復(fù)制的干擾研究,并取得了良好的進(jìn)展。為了發(fā)展控制口蹄疫的新方法,本研究對(duì)口蹄疫病毒的體內(nèi)外復(fù)制進(jìn)行了RNA干擾的探索,在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了靶向口蹄疫病毒的siRNA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并對(duì)所得的轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行抗病毒的評(píng)價(jià)。為RNAi應(yīng)用于口蹄疫病毒的基因功能研究

3、以及口蹄疫的防治積累了必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為動(dòng)物的抗病育種提供一條新的思路。 方法：對(duì)7個(gè)血清型的FMDV基因組序列進(jìn)行同源性比較后,初步篩選7個(gè)siRNA作用的靶位點(diǎn)。根據(jù)siRNA表達(dá)載體pSilenter 5.1-H1 Retro對(duì)插入序列的要求,設(shè)計(jì)合成了7個(gè)針對(duì)FMDV的shRNA表達(dá)序列的DNA序列。構(gòu)建針對(duì)以上靶序列的siRNA表達(dá)載體。選擇其中針對(duì)高保守的2B、3D區(qū)重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BHK-21單層細(xì)胞后接種0、A、

4、AsiaI型口蹄疫病毒檢測(cè)在細(xì)胞水平上表達(dá)的siRNA對(duì)病毒復(fù)制抑制效果；將重組質(zhì)粒注射乳鼠后用5 LD50和20 LD50的0型、AsiaI型FMDV感染觀察小鼠死亡情況：在對(duì)細(xì)胞水平病毒繁殖有一定效果的基礎(chǔ)上,利用顯微注射法構(gòu)建了靶向口蹄疫病毒2B、3D區(qū)的siRNA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。為了檢測(cè)siRNAs抗病毒的活性,我們對(duì)F1代成年鼠直接皮下接種0.5ml 100 LD50 AsiaI FMDV口蹄疫病毒,72h后小鼠經(jīng)眼眶放血處

5、死,及時(shí)取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟制備常規(guī)病理切片,同時(shí)觀察病變。用免疫組織化學(xué)染色法來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)口蹄疫病毒的抵抗作用。 結(jié)果：經(jīng)酶切和序列測(cè)定,正確構(gòu)建了靶向FMDV的siRNA表達(dá)載體,分別命名為：pSi-FMDV1、pSi-FMDV2、pSi-FMDV3、pSi-FMDV4、pSi-FMDV5、pSi-FMDV6、pSi-FMDV7。用大量制備的重組質(zhì)粒pSi-FMD2、pSi-FMD3轉(zhuǎn)染BHK-21單層細(xì)胞

6、后接種病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象的程度要輕；不同時(shí)間段收集的細(xì)胞上清液測(cè)得的TCID50值比對(duì)照有一定程度的降低。注射重組質(zhì)粒后對(duì)小鼠攻毒可使小鼠模型發(fā)病率降低,小鼠的死亡數(shù)減少。在以上基礎(chǔ)上將上述兩個(gè)包含有整個(gè)表達(dá)框的siRNA片段經(jīng)顯微注射法構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠模型。FMD2基因共注射506枚受精卵,移植到23只假孕母鼠輸卵管內(nèi),其中17只懷孕,產(chǎn)仔104只。FMD3基因共注射469枚受精卵,移植到22只假

7、孕母鼠輸卵管內(nèi),其中9只懷孕,產(chǎn)仔55只。所有F0代小鼠經(jīng)PCR檢測(cè),結(jié)果共有6只為陽(yáng)性。轉(zhuǎn)基因親代小鼠與正常異性健康小鼠交配后,其后代鼠經(jīng)PCR檢測(cè),有20％-30％遺傳獲得轉(zhuǎn)基因；轉(zhuǎn)基因小鼠之間進(jìn)行交配后,100％的后代鼠遺傳獲得轉(zhuǎn)基因。目前,FMD2基因傳代到F3代。FMD3基因已經(jīng)傳至F6代,仍有2096左右轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠檢出。轉(zhuǎn)基因小鼠外表未見任何異常。對(duì)F1代成年鼠直接感染口蹄疫病毒,感染后的轉(zhuǎn)基因小鼠取組織制備石蠟切片,與

8、正常小鼠感染后的組織切片比較病理變化的程度；同時(shí)對(duì)切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達(dá)的siRNA對(duì)病毒復(fù)制的抑制效果。與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)基因小鼠攻毒后各組織器官病變輕微；其中,脾臟的脾小體明顯增大,顯示轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫功能加強(qiáng)；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,在對(duì)照組小鼠的脾臟、肝臟和。腎臟中有病毒粒子的存在。而在轉(zhuǎn)基因小鼠,只在脾臟和肝臟中可見少量的陽(yáng)性病毒粒子。 結(jié)論：以上結(jié)果表明設(shè)計(jì)的siRNA在細(xì)胞水平上和個(gè)體水平