1、本論文應用代謝控制發(fā)酵原理，系統(tǒng)地研究了L-精氨酸產生菌的選育、代謝流量分析以及搖瓶發(fā)酵條件等，主要研究內容和結果如下： 以谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)GWY020為出發(fā)菌株，經化學和物理誘變處理，用精氨酸甲基酯(AE)、磺胺胍(SG)、D-精氨酸(D-Arg)、脯氨酸(Pro)及琥珀酸(Suc)為唯一碳源平板定向篩選，成功選育出一株L-精氨酸產生菌GU1089(AEr，SGr，Sucg，D

2、-Argr，Pros)。在以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵90h，產酸可達19.27g/L。 建立并完善了谷氨酸棒桿菌GWY020及其2個逐步疊加不同遺傳標記的突變株HUI1821和GUI089合成L-精氨酸的中心代謝網絡。分別測定了它們在特定培養(yǎng)時段(50～52h)L-精氨酸等代謝物的胞外濃度，由此計算這一時段這些代謝物在發(fā)酵液中積累(或消耗)的速率，分別作出這3株菌在擬穩(wěn)態(tài)下的代謝流量分布圖，進而研究育種過程中不同

3、遺傳標記的疊加對代謝網絡中L-精氨酸合成流量分布的影響。結果表明遺傳標記的引入使流量分配發(fā)生了重大變化，節(jié)點處的流量分配朝著有利于L-精氨酸合成的方向改變。從代謝流量分析角度上，證明結構類似物抗性和敏感性突變是代謝流導向和設計育種的有效手段，代謝流量分析將成為設計育種的提供新思路。 對菌株GUI089進行了培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化。得到最佳的種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，玉米漿25，硫酸銨25，KH2PO41，MgSO4·7H

4、2O0.5，碳酸鈣20，pH7.0，同時確定裝液量25mL/250mL；最佳發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖99.11，(NH4)2SO437.63，玉米漿20.90，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O0.6，生物素80μg/L，CaCO325；搖瓶發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH7.2，種齡為18h，接種量8％，裝液量為15mL/250mL，往復式搖床30℃培養(yǎng)，搖床轉速100次/min，發(fā)酵周期90h。優(yōu)化后最終產酸可達21.70

5、g/L。 結合菌株GUI089發(fā)酵過程曲線，對發(fā)酵過程進行了補加一些營養(yǎng)源的研究，結果表明，采用恰當的方式補加葡萄糖、谷氨酸和氨水，Lμ精氨酸產酸都有不同程度的提高。 在對谷氨酸棒桿菌GUI089代謝網絡和發(fā)酵特性研究的基礎上，通過添加適量的氨基酸、有機酸和維生素等對L-精氨酸發(fā)酵進行代謝調控。結果發(fā)現(xiàn)大部分添加物對L-精氨酸的積累都有一定的影響，特別是L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸、草酸、

6、丙二酸、琥珀酸、煙酸、維生素B6、葉酸和硫胺素等添加物對菌株GUI089合成L-精氨酸明顯有促進作用，添加后最大產酸量比不添加任何物質提高10％左右。添加蛋白胨和牛肉膏等會導致產酸降低，而添加SDS、氯霉素、豆餅水解液和酵母膏等對產酸有一定的促進作用。在培養(yǎng)基中添加表面活性劑吐溫80和穩(wěn)定劑植酸鈉均會抑制菌體生長并導致產酸下降。從代謝層面上分析，這些添加物除了促進菌體自身生長，同時防止了菌體對各添加物的過量合成，強化菌株GUI089合成