1、第一部分人臍動脈血管平滑肌細胞培養(yǎng)與鑒定 目的：建立人臍動脈血管平滑肌細胞(HASMC)體外培養(yǎng)模型。 方法：運用改良的植塊貼壁法體外培養(yǎng)VSMCs，在倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學(xué)觀察并對培養(yǎng)的細胞進行SM α-actin免疫組化鑒定。 結(jié)果：培養(yǎng)的細胞生長良好，光鏡下呈長梭形及“峰與谷”樣生長。SM α-actin免疫組化的結(jié)果顯示培養(yǎng)的細胞具有典型的HASMC特征。 結(jié)論：改良植塊貼壁法能使HASMC原

2、代培養(yǎng)的時間明顯縮短，傳代后HASMC生物學(xué)特征的穩(wěn)定性好，成功建立了HASMC體外培養(yǎng)模型。 第二部分ERK/P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在人臍動脈血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化中的作用 目的：探討PDGF-BB及米諾環(huán)素通過ERK/P38MAPK信號通路的調(diào)節(jié)，對人臍動脈血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的影響及其分子機制。 方法： ①建立HASMC體外培養(yǎng)模型，分為米諾環(huán)素0，7.5，15，30，60，120，150μm

3、ol/L組，采用MTT法檢測米諾環(huán)素對細胞的毒性； ②建立HASMC體外培養(yǎng)模型，分為無血清的DMEM，PDGF-BB(20ng/mL)，PDGF-BB(20ng/mL)+PD98059(30μmol/L)+SB203580(20μmol/L)，PDGF-BB(20ng/mL)+米諾環(huán)素(15μmol/L)，PDGF-BB(20ng/mL)+米諾環(huán)素(30μmol/L)五組，采用半定量RT-PCR檢測h-caldesmon，ca

4、lponin mRNA表達，Western Blot法檢測ERK1/2，P-ERK1/2，P38，P-P38蛋白表達。 結(jié)果： ①體外培養(yǎng)的HASMC在終濃度為120μmol/L米諾環(huán)素的培養(yǎng)液中孵育24h后對融合的HASMC的活性無影響，直到將米諾環(huán)素的濃度增加到150μmol/L時，才使HASMC的活性較對照組降低(P<0.05)； ②體外培養(yǎng)的HASMC在PDGF-BB(20ng/mL)的培養(yǎng)液中孵育24h

5、后，較對照組明顯下調(diào)h-caldesmon mRNA，calponin mRNA的表達水平(P<0.05)，表明PDGF-BB促進HASMC的去分化；在PDGF-BB(20ng/mL)+PD98059(30μmol/L)+SB203580(20μmol/L)中，h-caldesmonmRNA，calponin mRNA的表達較P組增加(P<0.05)，使的HASMC保持分化表型；在PDGF-BB(20ng/mL)+米諾環(huán)素(15μmol

6、/L)，PDGF-BB(20ng/mL)+米諾環(huán)素(30μmol/L)中，較P組上調(diào)h-caldesmon mRNA，calponin mRNA的表達(P<0.05)，表明米諾環(huán)素可以抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HASMC去分化； ③體外培養(yǎng)的HASMC在PDGF-BB(20ng/mL)+米諾環(huán)素(15μmol/L)的培養(yǎng)液中孵育24h后，P-P38蛋白表達較P組明顯下降(P<0.01)；在PDGF-BB(20ngmL)+米諾環(huán)素(

7、30μmol/L)組，P-ERK1/2和P-P38蛋白表達均較P組明顯下降(P<0.01)，表明米諾環(huán)素顯著抑制ERK/P38MAPK信號通路。 結(jié)論： ①PDGF-BB誘導(dǎo)HASMC的去分化，與ERK/P38MAPK信號通路有關(guān)，如抑制ERK/P38MAPK信號通路的活性，則HASMC保持分化表型； ②米諾環(huán)素對PDGF-BB誘導(dǎo)HASMC去分化的抑制作用，是通過抑制ERK/P38MAPK信號通路的活性，下調(diào)P