1、1995年科學家們發(fā)現了腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白:TRAIL，它是腫瘤壞死因子超家族成員之一，屬于Ⅱ型跨膜蛋白。人類的TRAIL蛋白是由281aa組成的，由843bp個編碼序列組成。其胞外區(qū)114～281aa為膜結合型TRAIL，能在體外誘導多種腫瘤細胞的凋亡。由于TRAIL具有廣譜抗癌的功能，且其對與正常的組織和細胞幾乎是無毒的，所以近年來它作為新型抗腫瘤藥物在臨床得到了廣泛應用。但是，對于某些種類的腫瘤細胞，TRAIL對它們

2、誘導凋亡的作用并不明顯。研究顯示NF-κB的活性與TRAIL的作用密切相關左右，TRAIL可以激活NF-κB信號通路，而在NF-κB活性高的細胞系中，TRAIL的誘導凋亡效果明顯下降。
　　 Par基因(prostate apop tosis response)是在1994年由Sells等人在鑒別篩選誘導凋亡的基因時，采用示差雜交法從凋亡的前列腺癌細胞中分離出的。par基因包括par-1、-2、-3、-4、-5，而其中par-4

3、基因編碼的Par-4蛋白與細胞凋亡的關系最為密切，在前列腺癌細胞凋亡時呈特異性雙峰表達。Par-4基因位于人類染色體12q21上，其基因產物Par-4蛋白在細胞中廣泛存在，在胞內胞外都具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，但不影響正常細胞的生長。因此Par-4就成為理想的抗腫瘤藥物備選分子。Par-4蛋白的C端具有1個亮氨酸拉鏈結構域，其N端含有兩個入核信號序列，分別為NLS1(20-25)和NLS2(137-153)。其中NLS2序列含有一個特

4、殊的結構域SAC(the selective for apoptosis induction cancer cells)，經過試驗證實SAC即為Par-4誘導細胞凋亡的關鍵結構域，單獨的SAC結構域即能產生誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
　　 研究顯示Par-4的凋亡作用主要是通過和分子伴侶GRP78結合，然后抑制NF-κB等通路來實現的。Par-4的這一特性正好彌補了TRAIL對某些NF-κB高活性的腫瘤細胞治療效果不佳的缺陷。

5、r>　　 本研究中，我們嘗試將SAC氨基酸片段與人TRAIL氨基酸片段以柔性氨基酸短臂，頭尾相連融合成為一條多肽鏈SAC-TRAIL，即:SAC-(GGGGS)-TRAIL，以增強抗腫瘤的效果。我們通過PCR和限制性內切酶酶切、連接技術，獲得編碼蛋白SAC-TRAIL的基因序列，構建了含編碼人SAC-TRAIL基因的重組質粒，在宿主菌E.coli BL21中得到了較高水平的表達，并用麥芽糖結合蛋白親和層析柱對表達產物進行了初步純化，獲

6、得了融合了麥芽糖結合蛋白標簽的可溶性重組蛋白MBP-SAC-TRAIL。最后，對MBP-SAC-TRAIL的生物學活性進行初步研究。
　　 第—部分:SAC、SAC-TRAIL編碼序列的構建和重組蛋白誘導表達與純化
　　 以pBV220-TRAIL為模板設計一對引物，我們采用PCR技術擴增得到TRAIL。通過公司合成了SAC序列，將其中9個密碼子更換為大腸桿菌偏愛型密碼子，將此SAC序列作為模板設計引物，用PCR技術得到

7、SAC序列。對SAC和TRAIL的PCR產物分別設計另兩對引物進行PCR擴增使得兩片段上附帶一小段柔性氨基酸鏈接臂的編碼序列，并且兩片段首尾均帶上了酶切位點;以pMAL-C2x為載體，利用酶切連接技術將酶切后的SAC、TRAIL、pMAL-C2三片段鏈接構建重組質粒。至此，獲得重組蛋白SAC-TRAIL的基因編碼序列。
　　 以E.coli BL21為表達宿主菌，用測序正確的重組質粒pMAL-SAC-TRAIL進行轉化，選取陽性

8、克隆菌落用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導表達重組蛋白MBP-SAC-TRAIL，并用MBP親和層析柱純化。經SDS-PAGE和免疫印跡驗證，在預期分子量（約70KD）的位置可見明顯蛋白條帶。
　　 第二部分:SAC、SAC-TRAIL生物學活性研究
　　 用體外藥物實驗驗證重組蛋白的誘導凋亡活性。體外培養(yǎng)腫瘤細胞(單細胞肺癌細胞H460)，分為不給藥的對照加MBP組、MBP-SAC-TRAIL組、MBP-TRAIL組，

9、和加蛋白藥物組進行對比，計算抑制率。之后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡技術對正常細胞（人臍靜脈內皮細胞HUVEC）和腫瘤細胞（單細胞肺癌細胞H460、胃癌細胞7901、胃癌細胞823、宮頸癌細胞HeLa），分為不給藥的對照加MBP組、MBP-SAC-TRAIL組、MBP-TRAIL組，對5種細胞的凋亡情況進行檢測和統(tǒng)計，從而評價重組蛋白的生物學活性。最后通過Western blot實驗檢測腫瘤細胞(單細胞肺癌細胞H460)的NF-κB信號通

10、路激活情況，以驗證融合蛋白的雙功能。
　　 實驗結果:
　　 編碼SAC-TRAIL的基因序列得以成功地構建并克隆，重組蛋白在原核表達系統(tǒng)中較高效表達，大部分融合蛋白在細胞破碎后的上清中以水溶形式存在，其表達量為15.9％，并能被MBP親和層析柱分離純化，純化后蛋白純度達到89.6％。
　　 體外細胞實驗證明，MBP-SAC-TRAIL具有很強的的抗腫瘤活性，在50μM的濃度下，作用12個小時后4種腫瘤細胞均發(fā)生