1、本研究以EDSV京911株為基礎(chǔ)材料，經(jīng)過(guò)鴨胚繁毒、提取DNA，并以此為模板，參考GenBank上發(fā)表的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株AV-127的全基因序列(序列號(hào)AC000004)設(shè)計(jì)了8對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增出目的基因，并將其克隆到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到宿主菌TG1感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)質(zhì)粒PCR、酶切鑒定以及測(cè)序證明，最終得到了該株病毒包含52/55k、Ⅲa、五鄰體、pⅦ、pⅩ、pⅥ、六鄰體、EP、100k、pⅧ和纖維蛋白的部分基因，共15715

2、bp。將EDSV京911株與其它腺病毒進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果顯示EDSV京911株與AV-127株高度同源，除纖維蛋白和pⅧ外，其它蛋白的同源性都在99.00％以上，其中五鄰體、六鄰體、巰基內(nèi)肽酶、PⅥ和PⅩ氨基酸序列完全一致，由此推論EDSV京911株與AV-127株可能為同一基因型。同時(shí)，根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果繪制了五鄰體、六鄰體和巰基內(nèi)肽酶系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果顯示EDSV與OAV287和BAdV-4遺傳關(guān)系最近。 根據(jù)已獲

3、得的京911株核苷酸序列，并參考AV-127株的五鄰體、纖維蛋白和六鄰體全基因序列，分別設(shè)計(jì)合成了帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物，最終克隆得到包括起始密碼子和終止密碼子在內(nèi)的完整基因序列。將目的基因通過(guò)EcoRI和HindⅢ位點(diǎn)插入到表達(dá)載體pET-30a(+)，獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pET-30a-Penton、pET-30a-Fiber和pET-30a-Hexon，將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAG