1、研究背景：年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)在老年人群中,是最常見的、導致不可逆視力損害(包括法定盲)的主要原因之一。脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是AMD最嚴重的形式。目前，AMD的治療方法包括激光治療,光動力療法(photodynamic therapy,PDT),玻璃體內(nèi)注射皮類固醇類藥物和抗血管生成因子的治療。但這些方

2、法都不能“治愈”AMD或者逆轉它的病程,只是試圖避免進一步視力損害。選擇靶向骨髓來源細胞(bone marrow–derived cells,BMCs)治療AMD是一個有前景的治療途徑。通過體外培養(yǎng)和局部給藥的方式,BMCs能有利于修復和再生視網(wǎng)膜和脈絡膜組織的損傷或變性。然而,盡管靶向BMCs治療AMD是一個令人振奮的途徑,但BMCs在外周循環(huán)的數(shù)量有限,使這一治療轉入臨床應用還面臨很大障礙。目前的技術還達不到使體外擴增的BMCs能被

3、常規(guī)用于細胞治療。
　　骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)可能代表一個重要的內(nèi)源性修復途徑。體內(nèi)動員和擴增骨髓來源的EPCs能對組織修復提供充足的自體細胞,因而可能解決目前細胞治療的瓶頸問題?；|(zhì)細胞衍生因子(stromal cell-derived factor1α,SDF-1α)及其受體CXCR4的相互作用是調(diào)控EPCs動員的關鍵。最近的發(fā)現(xiàn)提示肽酶CD26(dipept

4、idyl peptidase IV,DPP IV)能降解和失活骨髓內(nèi)SDF-1α,最終導致阻斷SDF-1/CXCR4 axis,是EPCs動員一個重要的調(diào)控機制。而且,血管緊張素轉換酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制劑能調(diào)控CD26/DPP IV從骨髓動員EPCs。盡管骨髓來源的EPCs參與了CNV的形成,但是否誘導體內(nèi)EPCs動員對CNV是有益的仍然未被充分確定。EPCs能否在CNV損傷區(qū)域發(fā)

5、揮保護作用還需要進一步被揭示。
　　目的和內(nèi)容：本研究的目的是探討調(diào)控 CD26/DPP IV系統(tǒng)(CD26/DPP IV system)增加體內(nèi)EPCs動員在CNV形成中的作用。確定是否在激光誘導的CNV，EPCs內(nèi)源性的損傷修復機制和星形膠質(zhì)細胞相關。本研究使用激光誘導的小鼠CNV模型1)觀察ACE抑制劑(ACE inhibitor,ACEI),咪達普利(imidapril)在體內(nèi)調(diào)控CD26/DPP IV system的作用

6、,探討在激光誘導的損傷條件下,ACEI對骨髓和外周血中肽酶活動的影響;2)觀察ACEI調(diào)控CD26/DPP IV system降解SDF-1α,阻斷SDF-1/CXCR4 axis,動員體內(nèi)EPCs參與激光誘導的CNV形成的作用;確定在損傷條件下,ACEI能否通過調(diào)控 CD26肽酶活動誘發(fā) EPCs動員;3)觀察動員的EPCs靶向視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(nerve filber layer,NFL)的星形膠質(zhì)細胞(astrocytes)抑制C

7、NV形成的作用。探討EPCs在激光誘導的CNV可能通過保護星形膠質(zhì)細胞,發(fā)揮內(nèi)源性的損傷修復作用。
　　方法：532nm二極管激光器誘發(fā)C57BL/6J小鼠Bruch’膜的破裂建立CNV模型。小鼠被隨機分為5組,在激光誘導CNV前5天,小鼠被分別預處理給予胃飼磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS),胃飼咪達普利和/或皮下注射Diprotin-A(DPP IV抑制劑)治療持續(xù)直到激光誘導后的14天

8、。正常對照為無激光和無干預組。(1)熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測:在激光誘導CNV后12天,獲得所有動物的外周血和骨髓樣本。心臟穿刺獲得外周血,同時股骨的骨髓細胞被提取。外周血細胞和骨髓細胞經(jīng)鑒定使用單個核細胞部分。檢測結合異硫氰酸熒光素(fluorescein isocyanat,FITC)-CD26單克隆抗體的CD26+細胞在外周血和骨髓中的數(shù)量。單個核細胞

9、雙標 FITC-CD34單克隆抗體和藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)-Flk-1單克隆抗體被鑒定為EPCs。流式細胞儀計數(shù)循環(huán)EPCs(CD34+/VEGFR2+cells)的數(shù)量。(2)淋巴細胞絲狀肌動蛋白(filamentous actin，F(xiàn)-actin)聚合作用檢測。小鼠的全血樣本收集來自激光誘導 CNV后12天。細胞刺激或未刺激30nM的重組小鼠SDF-1蛋白和FITC-鬼筆環(huán)肽(FITC-phalloidin)染

10、色。流式細胞儀檢測細胞內(nèi)平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)。(3)分別在不同干預的第1、5天和激光誘導CNV后3、7、14天尾靜脈取血,外周血白細胞(white blood cells,WBCs)計數(shù)。(4)全自動酶標儀檢測CD26肽酶活動,血漿和骨髓上清收集在激光誘導 CNV后12天。肽酶活動通過檢測生成對硝基苯胺(p-Nitroaniline,pNA)的水平,以酶的活性濃度單位(U/L)來

11、表示。酶標儀讀數(shù)405波長的吸光值。(5)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)SDF-1水平:激光誘導CNV后3、7、14天,全血離心收集血漿,同時來自股骨的骨髓上清被提取。ELISA檢測血漿和骨髓上清的SDF-1α濃度。(6)熒光血管造影(fluorescein angiography,FA)評價激光誘導CNV后13天的熒光滲漏情況。FA圖像被采集在注射造影劑后4-6分鐘。

12、按評分標準比較 CNV的滲漏情況。(7)組織病理學觀察 CNV厚度、直徑和面積。在激光誘導 CNV后14天,蘇木精和伊紅(Hematoxylin-Eosin,HE)染色觀察 CNV的厚度和直徑,FITC-植物凝集素(fluorescein isocyanate-Griffonia simplicifolia isolectin-B4,FITC-Isolectin B4)染色檢測CNV表面積。(8)免疫熒光標記神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial

13、 fibrillary acidic protein，GFAP),激光誘導CNV后14天觀察視網(wǎng)膜NFL星形膠質(zhì)細胞的表達。(9)蛋白印記法(western blotting)檢測激光誘導CNV后14天視網(wǎng)膜GFAP蛋白的表達。
　　結果：(1)ACEI能夠調(diào)控CD26/DPP IV system打破骨髓和外周血之間的肽酶活動的平衡。激光誘導CNV后12天,咪達普利不能改變骨髓CD26+細胞數(shù)量,但增加了CD26/DPP IV肽酶

14、活動。在外周血,咪達普利由于抗炎作用下降了WBCs數(shù)量,導致CD26+細胞數(shù)量明顯減少,最終下降外周血總的CD26/DPP IV肽酶活動,而且Diprotin-A能完全阻斷咪達普利調(diào)控CD26/DPP IV system的作用。(2)ACEI能夠通過調(diào)控CD26/DPP IV system阻斷了SDF-1/CXCR4 axis,動員EPCs到外周循環(huán)。在激光誘導CNV后12天,咪達普利明顯下降了骨髓SDF-1的水平,釋放大量失活的SDF

15、-1到外周循環(huán),導致外周循環(huán)血的SDF-1水平增高和外周血中SDF-1誘導的F-actin聚合作用下降。咪達普利組的這個現(xiàn)象與骨髓內(nèi)肽酶活動增高和外周血中肽酶活動的降低有關。最終,逆轉的骨髓和外周血 SDF-1濃度梯度導致顯著增加了EPCs從骨髓動員到外周循環(huán)。而且,在激光誘導的CNV,咪達普利對EPCs的動員作用完全被Diprotin A阻斷了。(3)咪達普利能夠抑制CNV的形成與動員的EPCs對視網(wǎng)膜NFL星形膠質(zhì)細胞有保護作用密切

16、相關。在激光誘導CNV后13天行眼底FA檢查,咪達普利比其它各組明顯減少了CNV的滲漏。HE和FITC-Isolectin B4染色均顯示咪達普利抑制了CNV,比其它各組明顯減少了的病變的直徑、厚度和面積。GFAP上調(diào)是星形膠質(zhì)細胞活化的標志。GFAP免疫熒光染色顯示咪達普利組視網(wǎng)膜NFL上GFAP免疫反應的細胞較其它各組明顯增高。Western blot檢測各組視網(wǎng)膜內(nèi)GFAP蛋白表達比較,在激光誘導CNV后14天檢測。咪達普利組比溶

17、劑組明顯增加了GFAP蛋白的表達。
　　結論：本研究證實(1)在激光誘導CNV損傷時,ACEI顯著增加骨髓微環(huán)境內(nèi)的CD26/DPP IV的肽酶活動,降低了外周循環(huán)的肽酶活動,破壞了骨髓和外周循環(huán)蛋白水解活動的平衡,有效的活化了CD26/DPPIV system。(2)CD26/DPP IV system通過增加骨髓內(nèi)蛋白水解SDF-1的活動,能負向調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4 axis,引起循環(huán)血中SDF-1水平增加,逆轉骨髓和外

18、周血的SDF-1濃度梯度,引起EPCs從骨髓動員到外周循環(huán)。(3)動員的骨髓來源的EPCs靶向NFL的星形膠質(zhì)細胞,可能通過內(nèi)源性修復途徑抑制了激光誘導的CNV。
　　動員骨髓來源的EPCs能抑制激光誘導的CNV。本研究首次明確了 EPCs參與CNV的形成是有積極的作用。ACEI調(diào)控CD26/DPP IV system動員EPCs可能代表一個重要的內(nèi)源性修復途徑。這一研究結果不但為體內(nèi)擴增骨髓來源EPCs治療眼新生血管提供了新奇的