1、前言
　　 喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤,發(fā)病率約占全身腫瘤的1-5％,并且發(fā)病率呈不斷增長的趨勢:北美每年有13000例患者被診斷為原發(fā)性喉癌；在我國,喉癌的發(fā)病率在呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤中占據第二位,華北、東北地區(qū)是喉癌的高發(fā)區(qū)。手術是目前治療的主要手段,盡管早期喉癌患者的生活質量由于喉部分切除術的應用得到了較大的改善,但晚期喉癌患者的生活質量及生存率在最近的30年中無明顯變化。喉癌發(fā)生的病理分子機制仍不清楚,探討其發(fā)生、發(fā)展的分子

2、機制無論對喉癌的早期診斷,還是有效治療都具有重要意義。在前期的工作中,我們發(fā)現(xiàn)在喉癌組織中表達下調的SH3GL2蛋白在喉癌細胞系中可以和SP100蛋白結合而相互作用,提示SP100蛋白可能與喉癌的發(fā)生和進展相關,在喉癌發(fā)生演進中發(fā)揮一定的作用。
　　 SP100蛋白,全名為SP100核抗原(SP100 nuclear antigen),屬早幼粒白血病核小體(promyelocytic Leukaemia nuclear body

3、,PML NBs)相關蛋白家族成員,含有SP100HMG、SP100A、SP100B和SP100C四種異構體。4種SP100蛋白異構體在氨基端共享同源SP100結構域,不同異構體在羧基端的SAND、PHD(planthomeodomain zinc finger)、Bromo或HMG(High Mobility Group,高遷移率組)結構域存在差別。SP100蛋白己被證實參與病毒感染、病毒相關蛋白相互作用、自身泛素化調節(jié),并在干擾素、

4、p53等多個信號通路中發(fā)揮作用。目前有關其在人體腫瘤中的研究尚未見報道。
　　 在本研究中,我們將明確SP100基因在不同腫瘤細胞系及喉癌大體組織標本中的表達方式。同時,深入研究SP100HMG的生物學功能及其與SH3GL2蛋白的相互作用方式。一方面可為闡明SP100基因在喉癌發(fā)生和發(fā)展過程中的分子機制創(chuàng)造條件并提供新的線索,另一方面為開展以SP100HMG為靶點或通過蛋白相互作用設計競爭性抑制劑的喉癌診斷和治療奠定基礎。

5、>　　 材料與方法
　　 通過半定量PCR和實時定量PCR分別檢測SP100基因mRNA在人喉癌Hep2細胞系、人宮頸癌HeLa細胞系、人肝癌Bel細胞系、人胃癌SGC7901和BGC823細胞系、人胚腎HEK293細胞系和胎兒胃上皮GES細胞系中的表達情況。選取2004年1月-006年12月于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科診斷為喉鱗狀細胞癌的病例96例,收集喉癌組織及癌旁黏膜組織標本及相應病例臨床資料,采用RT-PCR、

6、Western Blot和免疫組織化學方法研究SP100基因在喉癌大體組織標本中表達情況,應用統(tǒng)計學方法分析臨床病理資料與SP100表達間的關系。
　　 通過RT-PCR分析SP100HMG轉錄本在人喉癌Hep2細胞系、人宮頸癌HeLa細胞系、人肝癌Bel細胞系、人胃癌SGC7901細胞系、BGC823細胞系、MKN細胞系、人胚腎HEK293細胞系和胎兒胃上皮GES細胞系中的表達情況；構建RFP-SP100HMG表達載體,轉染H

7、ep2細胞,通過Western blot和RT-PCR檢測Hep2細胞中SP100HMG表達水平,同時觀察轉染后細胞形態(tài)學、細胞增殖能力、細胞體外侵襲能力和細胞凋亡水平的變化,綜合分析SP100HMG在喉癌細胞中的生物學功能。通過免疫共沉淀技術和免疫熒光技術分析SP100HMG和SH3GL2蛋白結合及區(qū)域定位；通過生物信息學技術對SP100HMG-SH3GL2結合區(qū)域進行預測,構建該結合區(qū)域肽鏈表達載體、通過免疫共沉淀對SP100HMG

8、-SH3GL2的蛋白結合區(qū)域進行驗證,進一步揭示其參與蛋白質間結合的肽鏈片段。
　　 結 果
　　 1、半定量和實時定量RT-PCR結果表明Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823腫瘤細胞系中SP100 mRNA水平較黏膜上皮細胞系GES降低；
　　 2、RT-PCR和Western blot結果顯示,喉癌組織中SP100 mRNA和蛋白表達水平均低于癌旁對照組織,蛋白表達下調水平與mRNA表達下

9、調水平一致；
　　 3、免疫組織化學分析SP100蛋白表達位于細胞核和細胞質,蛋白表達水平與喉癌細胞病理分化程度相關,低水平表達時SP100蛋白從細胞核向細胞質移位；
　　 4、RT-PCR結果顯示在Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823、MKN腫瘤細胞系中SP100HMG mRNA水平較黏膜上皮細胞系GES降低；
　　 5、RFP-SP100HMG表達質粒轉染Hep2細胞后,細胞中SP100蛋

10、白表達水平顯著增加,RT-PCR顯示SP100HMG表達水平亦顯著增加:
　　 6、SP100HMG對人喉癌Hep2細胞生物學行為的影響:RFP-SP100HMG表達質粒轉染Hep2細胞可以觀察到明亮的紅色熒光蛋白表達,轉染細胞形態(tài)明顯變圓、邊緣變鈍,細胞凋亡率增高、侵襲力顯著降低,細胞增殖水平較對照組細胞無明顯變化；
　　 7、免疫共沉淀顯示SP100HMG和SH3GL2在Hep2細胞內結合,免疫熒光顯示SP100HM

11、G定位于細胞核,SH3GL2定位于細胞核和細胞質,二種蛋白結合區(qū)域定位于細胞核；
　　 8、生物信息學預測并經免疫共沉淀實驗證實SP100HMG蛋白與SH3GL2蛋白結合位點位于SAND-HMG區(qū)域。
　　 結 論
　　 1、SP100 mRNA在多個惡性腫瘤細胞系中表達下調,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展；
　　 2、喉癌組織中SP100在轉錄和翻譯水平上表達下調,是潛在的喉癌相關的抑癌基因；
　　 3、喉

12、癌組織中SP100蛋白表達水平、細胞內分布狀況在不同分化程度癌細胞中存在顯著差異性,提示在喉癌的不同階段可能發(fā)揮不同的作用；
　　 4、SP100HMG在不同腫瘤細胞系中表達水平較正常黏膜上皮細胞系表達下調,在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用；
　　 5、SP100HMG具有抑制喉癌細胞侵襲并增強細胞凋亡的能力,是喉癌相關的重要候選腫瘤抑制基因；
　　 6、SP100HMG通過SAND-HMG結構域與SH3GL2